病理实验技术培训

刘辉临床医学研究院基础病理平台,1,基础病理实验平台讲座,2013-1-21,内容,基础病理平台实验技术介绍病理室规章制度实验室安全操作仪器使用注意事项常规基础病理实验技术及注意事项,2,基础病理实验平台实验技术介绍,常规实验技术： 常规组织处理、石蜡组织包埋、石蜡组织切片、病理切片染色、特殊染色、免疫组化、细胞凋亡及原位杂交等技术待开展实验技术： 免疫双染、冰冻切片、FISH,实验室是科研学习的重要场所,实验室的安全有序管理是实验工作正常进行的基本保证。凡进入实验室进行实验、学习的人员，必须遵守实验室安全制度：,病理室规章制度,1、遵守实验室制度，按时上、下班，不迟到早退，必须认真填写实验室进出登记本，作息时间上午10:00-13:30，下午15:30-19:00，如需加班请填写加班申请表。2、进入实验室人员必须穿工作服，进行实验操作时要戴好口罩、帽子及乳胶手套，非实验人员不得进入实验室，严格执行安全操作规程。3、实验人员必须熟悉实验仪器的操作规程及注意事项,并认真填写仪器使用记录（包括使用时间、内容、运行情况等）。,5,4、自带实验药品、试剂进入本室需向带教老师申请，放入指定位置，并做好记录，尤其是有毒有害、挥发性试剂者。5、所有药品、试剂、溶液都应有正确清晰的标签，包括名称、浓度、规格等，绝对不要在容器内装入与标签不相符的药品，并按正确方法取用。6、实验室应保持照明良好，光线充足,地面无纸屑、无积水、无脏物，废弃物要倒在指定的垃圾桶内，黄色垃圾袋医用垃圾，黑色垃圾袋生活垃圾。7、实验完毕,应立即进行清洁整理，物归原处，将实验台、通风橱整理干净。,病理室规章制度,8、实验中应严格遵守仪器设备操作规程，如实记录实验数据、详尽准确,便于查阅。9、与实验无关物品不得带入实验室,实验室物品未经允许不得带出，如有特殊需要，需经批准。10、实验室内禁止打闹，吸烟、进餐、会客、喧哗，或作为学习娱乐场所，不得存放实验室外个人用品、仪器等。严禁在冰箱、温箱、烘箱、微波炉内存放和加工私人食品。11、节水、节电、节约实验用品。,病理室规章制度,7,12、加强实验室安全工作，确保人身安全，防止触电、中毒、爆炸等危险事故发生，做好安全防范工作，每日离室前要检查水、电、窗、门等有关设施的关闭情况（对需要系统恒温的仪器可不关闭电源），以保证实验室安全，确认安全无误，方可离室。发现有不安全因素要及时报告。13、实验结束后1个月内清理自己所用的试剂、耗材、切片、图像、实验数据等，本室不代为保管。14、填写实验室工作日志，做好实验准备工作，实验完毕，做好实验记录15、水槽内不许存放任何杂物，随时关闭水门。需长时间流水冲洗者，必须留人监护。包埋组织所用液体石蜡禁止倒入水池内。,病理室规章制度,病理室规章制度,16、申请者如工作需要需超时使用实验室时，应提前1天提出申请并填写表格，表格需经申请者导师或课题组负责人签字和临床医学研究院共享平台负责人签字，方可生效。超时使用实验室时间是指正常工作时间以外的时间。并且每天超时使用实验室时间最晚不得超过23：00（北京时间）。在超时使用实验室期间，申请者必须严格遵守临床医学研究院相关规定及条例，如果发生任何意外事故（包括人身意外事故和实验仪器损坏、失火等意外事故），按研究院相关规定，由申请者本人自行承担。,实验室安全,1、禁止使用实验室器皿盛装食物,也不要用茶杯,食具盛装药品,或用烧杯当茶具使用，操作高温实验，必须戴防高温手套。2、使用酒精喷灯时，应先检查酒精量，少于三分之一应及时添加酒精，酒精量最多不超过三分之二再点燃，用后应及时熄灭酒精灯。3、手上有水或潮湿请勿接触电器用品或电器设备；严禁使用水槽旁的电器插座（防止漏电或感电）。4、消防器材要放在明显位置，严禁将消防器材移作别用。5、使用后的锐器（切片刀及注射器）应当直接投入耐刺、防渗漏的利器盒，以防刺伤。,10,1、使用挥发性有机溶剂、强酸强碱性、高腐蚀性、有毒性药品必须在通风橱内进行操作。对废液要倒在统一指定的地方，及时销毁处理。2、严格区分医用固体废弃物（病理切片后废弃的人体组织、医学实验动物的组织、器官、分泌物、体液、排泄物、尸体以及病理组织蜡块等）投入黄色塑料袋、生活垃圾（黑色塑料袋）、及医用锐利废弃物（黄色锐器盒），分别放置，严格管理。,生物安全,11,3、DAB属于联苯胺类化合物(BZC)中的一种，被国际癌症研究中心 (IARC)确认为致癌物，需特别注意安全防护（需带口罩、帽子、手套）。使用DAB显色专用显微镜，专用DAB显色缸。禁用孵育湿盒及修复盒终止显色。使用后的DAB废液投入黄色塑料袋（医用固体废弃物）内。4、洗涤玻璃器皿时应先用洗洁精刷洗，流水冲洗干净后过3遍蒸馏水，方可使用。如有需要过酸处理的可向工作人员提出申请。,生物安全,12,仪器使用注意事项,1、烤箱：预设温度5862度之间，每次用毕后及时关门。 温箱：预设温度37度，为保证温度的恒定用毕后及时关门。 冰箱：公用设备请大家及时关门。2、显微镜：先开关，放切片置载物台，物镜调至低倍观察，调整好焦距后切换高倍观察，可适当调整光强度，用毕后将光强度调至最弱，然后关闭电源。3、离心机：用于离心浓缩抗体，注意配平，不要超过3000转。4、实验图像的拷贝：采图电脑禁止使用自带U盘，需要拷贝图像时向带教老师申请使用实验室内部移动存储设备。,13,5、移液器：使用前注意看清移液器的有效量程，移液器只能在特定量程范围内准确移取液体，如超出最低或最大量程，会损坏移液器并导致计量不准，吸液时，将移液器按钮按到第一档吸液，释放按钮。放液时，先按到第一档，打出大部分液体，再按下第二档，将余液排出。用毕后，要把移液枪的量程调至最大值的刻度，使弹簧处于松弛状态以保护弹簧。,吸头,套筒,容量显示窗,吸头脱卸按钮,体积调节旋钮,仪器使用注意事项,14,常规基础病理实验技术及注意事项,切片制备HE染色免疫组化原位杂交TUNEL法细胞凋亡检测,15,切片,烤片,染色,HE染色,特殊染色,免疫组化,原位杂交,TUNEL法细胞凋亡检测,技术流程图,16,细胞标本取材组织标本取材,标本取材,印片穿刺涂片培养细胞标本细胞爬片,实验动物穿刺活检手术切除,1.标本来源,17,2.注意事项组织标本的取材常受各种因素的影响，应注意：切取组织块的刀、剪必须锋利，切割时不能来回挫动，镊子夹取组织时不能猛压，以免组织受挤压；采取组织标本越新鲜越好，一般不超过死后24小时。取材部位主要是病变区，取病灶与正常组织交界区；必要时取远距病灶区的正常组织作对照；,标本取材,18,切取组织块大小，取材时组织块大一些，以220.5厘米为宜，最厚不宜超过0.5厘米，以便固定后可以进一步修剪。组织块病变一面应平整光滑，另一面可不平整，以便包埋时辨认；新鲜组织取材后,材料应保持清洁，应先用水或生理盐水冲洗干净,然后再入固定液；为充分保存组织的抗原性，标本离体后应立即处理或速冻进行冷冻切片，或立即用固定液固定，进行脱水、浸蜡、包埋。如不用迅速制片，也可贮于液氮或-70保存。,标本取材,19,1.目的 可使细胞内蛋白质凝固，防止细胞内酶反应过程，防止细胞自溶，保持细胞固有形态和结构；可以保存组织细胞的抗原性。固定不足，抗原会丢失； 固定过度，则抗原性质改变或抗原成分被遮蔽。2.原则 尽快,低浓度、短时间，防止干燥，固定后需充分冲洗。,标本固定,标本固定,3. 固定液的选择常用：10%中性缓冲甲醛 4%多聚甲醛磷酸缓冲液 Bouin液 戊二醛 乙醇 丙酮 注意：醛类固定液: 使蛋白质发生交联而起固定作用 ,影响细胞膜通透性,需酶消化或抗原修复。,21,4.各类固定液的应用多聚甲醛(常用4%)：可用于免疫电镜；也可用于免疫荧光以及TUNEL染色。 主要检测组织内一些性能娇弱的抗原甲醛(福尔马林)应用最广 优点：形态结构保存好，且穿透性强缺点： 甲醛放置过久可氧化为甲酸，使溶液pH降低，影响染色； 分子间交联形成的网格结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇，使之不能充分暴露。可造成假阴性的染色结果。,标本固定,22,冷丙酮 ：用于一般的免疫组化染色。 细胞爬片取出后，PBS洗2遍，便可加入冷丙酮于-20，固定10分钟。取出后，室温吹干，然后放入-20保存。95乙醇，可用于免疫组化。优点：穿透性强、抗原性保存较好。缺点：醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差，使蛋白变性的作用轻，固定后可再溶解；染色过程中，温育时间长，抗原可流失而减弱反应强度，室温固定15分钟后，将表面液体吹干，-20保存,标本固定,23,5.固定方法,浸入法：即将组织浸泡在固定液内（必要时在4下），固定时间根据抗原的稳定性以及固定液的性质而定，一般在2-12h之间。 新鲜冰冻切片固定于丙酮 单层细胞、病毒、细菌冷丙酮、冷乙醇 细胞悬液先固定，然后离心制成标本 一般组织新鲜取材、浸泡固定 灌注法：主要适用于动物研究，灌注固定不仅可以使固定液迅速到达全身组织充分固定，而且灌注能冲洗掉红细胞，排除过氧化物酶的干扰。,标本固定,24,6.注意事项：,力求保持组织新鲜，勿使其干燥；固定液必须有足够的量，在体积上一般大于组织20倍以上，否则组织中固定不良而影响效果；组织固定后，应充分水洗，去除固定液，以减少固定液造成的人为假象。固定时间因固定液而异组织固定时间最好在12h内，一般固定时间不应超过24小时。随着固定时间的延长对组织抗原的检出强度将逐渐降低。一般在室温下进行，电镜标本或固定时间较长可放置在4冰箱。,标本固定,处理,流程：,组织洗涤组织脱水组织透明组织浸蜡组织包埋,目的方法,目的常用脱水剂的使用方法,目的常用透明剂的使用方法,目的方法,26,处理,组织块处理时间,27,HE染色,苏木精 伊红染色法 ( hematoxylin-eosin staining ，HE)是石蜡切片技术里常用的染色法之一 。HE染色法是组织学、胚胎学、病理学教学与科研中最基本、使用最广泛的技术方法。 原理：脱氧核糖核酸（DNA）两条链上的磷酸基向外，带负电荷，呈酸性，很容易与带正电荷的苏木精碱性染料以离子键结合而被染色。伊红是一种化学合成的酸性染料，在水中离解成带负电荷的阴离子，与蛋白质的氨基正电荷的阳离子结合使胞浆染成红色或粉红色，与蓝色的细胞核形成鲜明对比。,28,石蜡切片HE染色步骤：1、脱蜡水合。2、水洗3次。3、苏木素染液染色5min。4、水洗玻片上多余染液，盐酸酒精分色数秒。5、流水冲洗15-30s，细胞核呈蓝色。6、伊红染液染色1-5min，水洗。7、脱水、透明，封片，镜下观察。,HE染色,29,细胞爬片HE染色1、取出细胞爬片，用PBS洗涤3次。2、样品固定：95乙醇固定20min，PBS洗涤2次，每次2min。3、其余步骤和石蜡切片3-7步相同。冰冻切片HE染色1、固定：固定1-2min。(配制方法：40%福尔马林15 mL，95%乙醇80 mL，冰乙酸5 mL )2、其余步骤和石蜡切片2-7步相同。,HE染色,30,染色结果：细胞核呈蓝色，胞浆呈红色，红细胞呈桔红色，其他部位呈深浅不同的红色。,HE染色,31,染色注意事项 1、脱蜡应彻底； 2、水洗时水流不能太急； 3、“分色”、“蓝化”时间要掌握好； 4、脱水要彻底； 5、适量滴加封藏剂。,HE染色,32,原理 免疫组化（Immunohistochemistry）：带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。 它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。,免疫组化,33,通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。,免疫组化,34,试剂准备,切片(防脱片),多聚赖氨酸, APES,一抗,多抗or单抗,兔or鼠, 注意种属特异性，针对检测组织种属,检测试剂盒,EliVisionTM plus 检测试剂盒（二步法）SP试剂盒（三步法）SABC试剂盒（三步法）,显色试剂盒,DAB试剂盒,其他,H2O2，二甲苯，酒精，缓冲液（PBS，柠檬酸缓冲液），抗原修复液（胰酶），正常动物非免疫血清,免疫组化,35,Primary Antibody,Secondary Antibody,Tissue Antigen,二步法是将二抗和酶通过一个多聚葡聚糖骨架联接成一个多聚体（即EliVision）直接放大信号40-50倍，把传统的二抗、三抗分别孵育合为一次孵育。特点灵敏度高只需要少数标记的二抗可以和相应的一抗反应省时、方便、背景低（避免了内源性生物素干扰）。,36,SP法（streptavidin-peroxidase）一抗生物素标记的二抗Streptavidin-HRP（HRP标记的链霉亲和素）简化实验步骤减少非特异性背景,37,ABC法 (Avidin Biotin-peroxidase Complex)一抗生物素标记的二抗Avidin-Biotin-HRP Complex（亲和素-HRP标记的生物素）,亲和素与HRP标记的生物素混合，放置30分钟。一个亲和素分子具有可与生物素结合的四个部位。大大增加了结合到生物素上的过氧化物酶，提高了显色反应的 灵敏度。,38,免疫组化,操作步骤,脱蜡，水化,PBS洗3次 X 3分钟,抗原修复,一抗,封闭内源性过氧化物酶,PBS洗3次 X 3分钟,二抗,PBS洗3次 X 3分钟,苏木素复染,自来水洗,DAB显色,脱水,封片,PBS洗3次 X 3分钟,结果分析,组织标本,细胞标本,石蜡切片冰冻切片,组织印片细胞爬片细胞涂片,标本来源,免疫组化,样品制备,Tissue Antigen,Primary Antibody,Secondary Antibody,Tissue Antigen,Labeled Antibody,40,抗原修复细胞通透与内源酶封闭 非特异性位点封闭,预处理,41,原理：甲醛的聚合作用，造成细胞内的蛋白质分子键相互交联及固定液的作用，使氨基酸残基在分子内或分子间形成醛键细胞内抗原决定簇被掩盖，抗原不能与抗体充分反应作用：掩盖的抗原决定簇或变性的抗原重新暴露抗原性得到一定程度的恢复提高免疫组化染色的阳性率,抗原修复,预处理,42,常用的修复方法从强到弱一般分为三种，高压修复 微波修复 胰酶修复,抗原修复的主要方法:,酶消化方法一般用于细胞内抗原,应用高频电磁波打开蛋白质间的交联键,具体操作：将切片放入 0.01 M 柠檬酸钠缓冲溶液（pH6.0）后，在微波炉里高火 4 min 至沸腾后，取出，冷却至室温，再加热，约4次，每次间隔补足液体，防止干片。,预处理,43,细胞通透与内源酶封闭,作用：使抗体能够充分地进入胞内进行结合反应灭活生物体内自身的内源酶（过氧化物酶、碱性磷酸酶）降低非特异性染色,用封闭通透液浸润切片 30 min（RT ） 配法：预热 40 ml PBS 加120ul TritonX-100 加热几分钟，在临用前加 400 ul的30H2O2。3% H2O2浸润切片10min（RT）,具体方法:,预处理,44,作用：组织切片上有些剩余的位点可以与一抗非特异性结合，造成后续结果的假阳性。封闭血清一般是和二抗同一来源的，血清中有一些动物自身的抗体，预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合，降低非特异性背景着色。,非特异性位点封闭,Blocking Buffer ：二抗免疫前血清、 3%BSA,预处理,将切片取出,周围水分用滤纸吸干,用组化笔在组织周围画上圈,在圆圈内组织滴入 5%羊血清（与二抗来源一致）后放入湿盒中,室温 下1030min。,具体操作：,预处理,46,一抗的选择 单克隆抗体 多克隆抗体二抗的选择 酶 - HRP、AP等 荧光基团 - Cy3 、Cy5、 FITC,多克隆抗体,单克隆抗体,抗体检测,47,多克隆抗体,纯化后的抗原直接免疫动物，并从该动物中所获得的免疫血清；特异性低，会造成抗体的交叉反应；但由于多克隆抗体能与抗原分子上多个抗原决定蔟发生结合，故广泛用于石蜡包埋组织切片中，其假阴性染色机会较少。,单克隆抗体,应用细胞融合杂交瘤技术通过免疫动物而制备的；针对一种抗原决定簇的一个B淋巴细胞克隆分泌的抗体；其特异性强、抗体产量高；有可能发生交叉反应。,抗体检测,一抗孵育: 可以特异结合底物，就是识别出我们想要检测的东西。一抗和底物结合与否用肉眼是看不出来的。,抗体检测,一抗孵育条件在免疫组化反应中最重要，包括孵育时间和抗体浓度。 一抗孵育温度有几种：4度、室温、37度，其中4度效果最佳；孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般37度1-2h，然后4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45min。具体条件还要摸索。,1.防止脱片；2.使抗原抗体结合更稳定。,抗体浓缩液应在-20保存，可以长达两年；用时取出，室温融解，如一次或短时间用不完，应进行小量分装，20保存，避免反复冻融；融解后抗体于28可以保存一个月。稀释的抗体不能长时间保存，在4下可存放1-3天，超过7天效价显著降低。抗体的最佳工作稀释度 ： 标准稀释度为1：100，则需作1：50， 1：100，1：200三个稀释的试验，再根据标记的结果来定最佳稀释度。一般每张组织切片需用试剂50ul。例如：8张 X 50ul = 400ul，而试剂标准稀释度为1：100 则需原液为400/100 = 4ul。常用0.01mol/L pH7.4 PBS或 TBS 缓冲液作抗体稀释液,抗体检测,具体做法： 甩去切片上的羊血清,用滤纸擦干组织周围残留血清，直接加入已稀释的一抗（1：50、100、200）后，放入湿盒中室温 1 小时，然后 4 度过夜，冰箱中取出后需37 复温 45 min。,Ab滴片图示：,抗体检测,合适,适中,太少,二抗孵育 可以和一抗结合，并带有可以被检测出的标记(如带荧光、放射性、化学发光或显色基团），作用是检测一抗。,抗体检测,二抗孵育条件：二抗一般室温或37度30min-1h，具体时间需要摸索。 但在免疫组化中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下，然后去摸索一抗浓度和孵育时间。实验计划：根据课题的内容选用动物，选用配套的 Ab。 如AbI鼠抗人的抗体，与其他种属间无 交叉，则不能用其他动物，而且Ab-必须是羊抗鼠。,显色反应（显色、复染、封片） 在免疫组化中，由于抗原抗体所形成的复合物本身没有颜色，不能直接观察，只能借助于其他某些化学基团的显色作用，是复合物显色，有利于显微镜下观察。,辣根过氧化物酶（HRP） 还原 供 氧体：3，3-二氨基联苯胺（DAB） H2O2 H2ODAB是过氧化酶的生色底物，在过氧化物酶催化下，形成棕黄色的沉淀。DAB有致癌性，避免皮肤接触和吸入,DAB显色液 DAB 50mg 0.05M TB 100ml 30%H2O2 30-40ul,显色反应,复染、脱水、透明、封片复染：目的是形成细胞轮廓，从而更好地对目标蛋白进行定位。 片子复染完后流水振洗，然后置于盐酸酒精中数秒（一定动作要快）后拿出流水振洗，在放入PBS中返蓝即可。,封片,组织切片的固定与保存有效避免组织直接与空气接触,54,石蜡 人乳腺导管癌ER染色，胞核阳性,DAB染色,石蜡，人甲状腺癌CD44V6染色，胞膜阳性，DAB染色,55,染色过程中的注意事项 切片脱蜡和水化要充分；加反应液时要覆盖组织充分；每次加 液前甩干洗涤液，但又防止干片。 以下原因可能导致片子着色不均匀：抗体没混匀、抗体孵育时，切片放倾斜、抗体孵育后 PBS 冲洗不充分、制片厚薄不均匀等问题。 一抗的清洗：单独冲洗，防止交叉反应造成污染。温柔冲洗，防止切片的脱落。推荐用浸洗方式；冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质。 PBS的PH和离子强度的使用：建议PH在7.4-7.6浓度是0.01M。中性及弱碱性条件（PH7-8）有利于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分解；低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利于分解。 苏木素复染时间需要摸索，尤其要考虑阳性染色的位置。,结果分析和判断,结果的判断原则对照染色设计 非特异染色 染色失败的原因及其处理方法,57,判断原则,必须设立染色对照：阴性对照，阳性对照抗原表达必须在特定部位：胞膜、核、浆，阳性表达不在抗原所在部位的着色，一概不能视为阳性。尽量避开出血、坏死及切片刀痕和界面边缘细胞的阳性表达阴性结果不能视为抗原不表达,对免疫组化标记结果的意义不能绝对化,58,(一）对照染色的目的 设对照的目的是为了排除假阴性和假阳性。假阴性的原因主要有三：组织处理不当，抗原丢失过多或被遮蔽；抗体失活、效价过低或稀释度不合适（主要指一抗，即特异性抗体）；染色步骤遗漏及差错，或显色剂的选择、缓冲液的pH和离子强度不当等。 假阳性均系由多种因素造成的非特异着色所致，原因主要有：自发荧光或内源酶等干扰；抗体试剂不纯(特别是一抗）；操作失误，如污染、切片干枯或显色剂操作不当等；Fc受体的干扰，等等。,对照设计,59,对照设计,阳性对照：已知阳性表达的组织自身对照：同一标本中不同组织对照阴性对照： A、阴性组织对照：已知阴性表达的组织 B、阴性试剂对照：空白对照,（二）对照的种类及其选用目的,60,阳性组织对照 指用已证实含有靶抗原的同源及不同源组织切片或细胞涂片与待检实验切片同时作同样处理和免疫染色的组织对照。正确的结果应呈现阳性，目的是为了证实所用免疫组化染色流程的有效性，排除假阴性的可能。阴性组织对照 指用已证实不含靶抗原的同步处理和免疫标记染色的组织对照。正确的结果应为阴性，目的是除外假阳性。,对照设计,61,阴性试剂对照 用于证实在免疫组化染色中所用试剂，尤其是特异性抗体试剂的有效性和可靠性而所设立的同步免疫染色对照，目的在于除外假阳性和证实所用免疫组化试剂及其技术方法的有效性和待检实验切片免疫标记阳性结果的可靠性。包括：空白对照；替代对照等。 阴性试剂对照的选用原则是：空白对照不能省，其他对照在预实验中应尽量多做，尤其是应用新抗体试剂；对照必需与实验片同步进行染色；对照的结果应附合要求。,对照设计,62,自身对照 指在同一标记切片上的自身组织成分的阴性背景对照。即与靶抗原阳性反应细胞或成分相邻的阴性背景结构的显色，结果应为阴性或着色较浅，需与阳性着色成分呈鲜明对比。目的在于排除内源性干扰产生的假阳性和因抗原弥散移位造成的错误结果。,对照设计,63,非特异染色是指免疫组化染色过程中产生的非靶抗原的呈色结果，属假阳性，又称背景着色，能严重干扰免疫组化染色结果的正确判断，应竭力避免或减轻。其原因涉及免疫组化染色流程的各个环节。,非特异性染色,抗体：纯化，浓度，时间，温度,清洗：充分,显色：时间,其他：脱蜡充分，无干片,封闭：H2O2， 非免疫动物血清,非特异性染色,组织内源性成分的干扰：自发荧光；内源性过氧化物酶-WBC，RBC内源性生物素-肝、胰、肾组织。试剂污染:质量差;交叉反应;Fc受体干扰等.组织处理不当(组织固定不及时或固定不良所导致的抗原弥散移位、洗涤不充分所导致的游离试剂残留等)。,65,免疫组化染色实验组与对照组结果分析表,66,阳性染色特点 Ag定位，胞浆、胞核、胞膜、间质具有结构性。（非特异性染色 细胞与 组织无区别） 染色强度不同：颜色深浅不一（非特异性染色 弥散性均匀）。组织切片制作过程的影响 固定不良非特异性染色，显示不均。 边缘干燥非