《蛋白质电泳与操作》PPT课件

蛋白质电泳与操作,福建中医药大学康复医学研究所林炜博士2012.4.13,Questions：什么是氨基酸？氨基酸有何结构特点？什么是肽？肽是如何形成的？形成肽的化学键是什么？什么是蛋白质？蛋白质的结构特点是什么？,蛋白质特性,氨基酸（aminoacid）含有一个碱性氨基和一个酸性羧基的有机化合物。是蛋白质的基本组成单位。氨基酸的酸碱性质氨基酸在水溶液或结晶内基本上均以兼性离子或偶极离子的形式存在。兼性离子：又称为两性离子是指在同一个氨基酸分子上带有能释放出质子的NH3+正离子和能接受质子的COO-负离子，因此氨基酸是两性电解质。氨基酸的等电点：氨基酸的带电状况取决于所处环境的PH值，改变PH值可以使氨基酸带正电荷或负电荷，也可使它处于正负电荷数相等，即净电荷为零的两性离子状态。使氨基酸所带正负电荷数相等即净电荷为零时的溶液pH值称为该氨基酸的等电点（isoelectricpoint）。,多肽（polypeptide）一个氨基酸的羟基与另一个氨基酸的羧基脱水缩合形成肽键（peptidebond）。,通常由10-100个氨基酸分子脱水缩合而成的化合物叫多肽，它们的分子量低于10,000Da（Dalton）.也有文献把由2-10个氨基酸组成的肽称为寡肽（小分子肽）；10-50个氨基酸组成的肽称为多肽；由50个以上的氨基酸组成的肽就称为蛋白质。,蛋白质特性,蛋白质结构一级结构（primarystructure）氨基酸之间以肽键形成的肽链中氨基酸的排列顺序。二级结构（secondarystructure）蛋白质分子中多肽链沿一定方向盘绕和折叠的方式。三级结构（tertiarystructure）蛋白质的二级结构基础上借助各种次级键卷曲折叠成特定的球状分子结构的空间构象。四级结构（quaternarystructure）多亚基蛋白质分子中各个具有三级结构的多肽链，以适当的方式聚合所形成的蛋白质的三维结构。,关于电泳,电泳（Electrophoresis）：是指带电荷的粒子或分子在电场中移动的现象。电泳技术：利用带电粒子或者分子在电场中移动速度不同而达到对粒子或分子进行分离的技术。,电泳的相关参数,电荷：粒子或分子的电荷性质决定其在电场中的迁移方向。分子大小：分子大小决定了在特定电场强度下一定时间内分子在介质中的迁移距离。电场强度：电场强度决定了带电粒子或分子在电场中的迁移速度。介质密度：介质密度决定了特定分子在其中的迁移距离，因此决定其对不同分子的分辨能力。,聚丙烯凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamidegel，PAG）丙烯酰胺单体和甲叉双丙烯酰胺交联剂在催化剂(如过硫酸铵，TEMED等)作用下形成的凝胶。凝胶孔径大小可以通过制备时所使用的浓度和交联度控制。聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamidegelelectrophoresis，PAGE）利用聚丙烯酰胺形成的凝胶对大分子生物物质（如核酸、蛋白质）通过附加电场使分子不同的按照分子量大小在凝胶中得到分离。蛋白质的聚丙烯凝胶电泳类型：按蛋白质变性与否分为变性电泳和非变性电泳；按凝胶浓度梯度分为不连续电泳与连续电泳；按电泳的向性分为单向电泳与双向电泳。,蛋白质变性电泳,蛋白质变性：蛋白质的三级结构和四级结构的结合力主要是半胱氨酸之间形成的二硫键（Disulfidebond）。而蛋白质三级结构和四级结构是蛋白质的功能基础。蛋白质变性就是使二硫键打开，从而使蛋白质亚基解离和三级结构打开，使蛋白质失去生物活性，故称变性（denature）。蛋白质变性的方法：95加热5分钟足以破坏蛋白质中的二硫键，但是当温度降至常温后，二硫键能够重新形成，这个过程称为复性（renature）。为了使变性后的蛋白不再复性通常使用-巯基乙醇（2-Mercaptoethanol）或二硫苏糖醇（Dithiothreitol，DTT）保护自由的半胱氨酸巯基。另外，为了避免复性，通常在加热后立即放入冰浴以减少蛋白质复性的机会。蛋白质变性电泳的方法：十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectrophoresis，SDS-PAGE）,SDS-PAGE原理：蛋白质在凝胶中的迁移率主要取决于分子大小、形状以及所带电荷多少。SDS是一种阴离子表面活性剂，在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的SDS能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上（达到饱和的状态下，每克多肽可结合1.4gSDS），使各种蛋白质SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。此时，蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小，而其它因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合公式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。,SDS-PAGE操作程序,蛋白质样品制备凝胶制备样品上样电泳凝胶染色电泳结果分析,来自培养细胞的样品：悬浮培养细胞：细胞清洗：对培养基中的悬浮细胞吹打混匀后移至15mlV型底离心管，台式冷冻离心机1000rpm（300G）4离心5min使细胞沉积在离心管底部，弃去培养液。加10ml冰浴预冷的PBS重新吹打混匀细胞后1000rpm（300G）离心5min，弃去PBS。重复此步骤三次。在最后一次清洗前对充分吹打混匀的细胞进行计数。贴壁培养细胞：细胞消化：吸弃细胞培养瓶中的培养液，并用适量预冷PBS漂洗一次，加适量（足以覆盖细胞）胰酶细胞消化液(Trypsin-EDTASolution，0.25%Trypsin和0.02%EDTA)，室温消化15min。加5ml含5%血清的培养基停止消化，吹打使细胞成为单细胞悬液。移至15mlV型底离心管，台式冷冻离心机1000rpm（300G）4离心5min使细胞沉积在离心管底部，弃去培养液。执行细胞清洗程序（见上）,蛋白质样品制备,细胞裂解：按照每106细胞加75100l细胞裂解液（RIPA，含蛋白酶抑制剂），强烈震荡30s后置冰浴30min，期间每5分钟震荡10s。台式冷冻高速离心机12000rpm，4离心5min。将上清移入另一干净Eppendorf管，样品可立即保存于-20。如有必要，取5l上清，ddH2O稀释4X后用Bradford法检测蛋白质含量。蛋白质变性根据需要取一定量裂解细胞样品，加4X蛋白质电泳上样液（含5%巯基乙醇）使终浓度为1X，混匀。95加热5min，立即置冰上，等待电泳。,试剂：ddH2O30%Acr-Bis(29:1)10XTris/Glycine/SDSbuffer,pH8.810XTris/Glycine/SDSbuffer,pH6.810%过硫酸铵（Ammoniumpersulfate，AP）TEMED（Tetramethylethylenediamine，四甲基乙二胺）*TEMED可以催化过硫酸铵产生自由基，从而加速丙烯酰胺凝胶的聚合。装置：,凝胶制备,凝胶分离范围：,SDS-PAGE凝胶的结构,浓缩胶（Stackinggel）：浓缩胶通常为5%聚丙烯酰胺凝胶,目的是使蛋白质样品集聚。分离胶（Resolvinggel）：分离胶浓度为6%20%，能够是不同的蛋白质按分子量大小分离。加样孔（well）：由加样梳形成的孔，相互之间有凝胶隔离，蛋白质样品加入孔内，并在电泳中互不干扰。每一个加样孔相对应的凝胶又称泳道。玻璃板（Glassplates）：构成凝胶的模板。隔条（spacer）:垫于玻璃板之间，使两块玻璃板之间形成灌胶的空间。,SDS-PAGE凝胶的工作原理,在SDSPAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是TrisHCL缓冲系统，浓缩胶是pH6.8，分离胶pH8.8；而电泳缓冲液使用Tris甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中，其pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而CL离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压剃度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。,凝胶配制的计算,凝胶配制步骤,安装灌胶模具：注意压紧，避免漏胶。配制分离胶溶液：配胶时分离胶的五个组分按表依次加入洁净的配制分离胶的小烧杯内，以搅拌混匀约10-20sec，均匀加入胶槽。灌制分离胶：灌胶后再在胶面上小心地铺上一几毫米厚的电泳缓冲液（pH8.8）（这可使凝固后的胶面平滑整齐），然后于37凝固15-30min。配制浓缩胶溶液：配胶时浓缩胶的五个组分按表依次加入洁净的配制分离胶的小烧杯内，以搅拌混匀约10-20sec，均匀加入胶槽，插入加样梳。灌制浓缩胶：浓缩胶是用于浓缩蛋白质样品，位于整块SDS-PAGE胶的上层。常用浓度是5%，pH6.8。并用加样梳形成加样孔。孔下留0.81.0cm的浓缩胶，以便蛋白质样品在这段胶的电泳中被浓缩并聚焦成窄线，有利于下面的分离胶分离不同分子量蛋白时形成清晰的条带。,蛋白质样品上样电泳,预电泳：配制完成的SDS-PAGE胶通常要预电泳510分钟，以去除未交联丙烯酰胺的影响。蛋白质的加样量：通常一个上样孔加样15l，含总蛋白量约为40-100g。加样模式：通常左右两侧的上样孔加510l蛋白标志，若样品数较少（7个），则左右两侧上样孔加23l蛋白质上样缓冲液，中间的孔加蛋白标志。起始电泳：电泳通常采用稳压模式，起始电压通常为70v。电泳分离电压：通常为100120V。结束电泳：电泳结束的标志通常以欲分离的蛋白质泳动到胶的1/22/3处，或者以溴酚蓝开始从胶底部泳出为标准。,SDS-PAGE电泳凝胶染色,银染(silverstaining),考马斯亮蓝染色（CoomassieBrilliantBluestaining）CoomassieBrilliantBlueR-250CoomassieBrilliantBlueG-250,凝胶结果分析,染色后的凝胶可以用凝胶扫描仪观测照相，也可平铺在普通扫描仪上扫描成图像。凝胶图像可通过电脑软件进行分析。确定目的蛋白的位置，根据蛋白标准条带确定蛋白质的相对大小。并可以通过软件计算不同泳道之间蛋白质的相对含量。,SDS-PAGE凝胶电泳的Q&A,Q：SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用？A:聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关；制胶缓冲液：浓缩胶选择pH6.8，分离胶选择pH8.8，选择TrisHCL系统，具体作用后面介绍；Q：TEMED与AP的作用？A：促凝作用，加速聚丙烯酰胺的凝固；Q：十二烷基硫酸钠（SDS）的作用？A：阳离子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。Q：提高SDS-PAGE电泳分辨率的途径？A：1、聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。建议做法：待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致SDS结晶。一般凝胶可在室温下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。2、一般常用的有氨基黑、考马斯亮蓝、银染色三种染料，不同染料又各自不同的染色方法，具体可参照郭尧君编著的蛋白质电泳技术手册P82-103。,Q：“微笑”（两边翘起中间凹下）形带原因？A：主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚的凝胶中。处理办法：待其充分凝固再作后续实验。Q：“皱眉”（两边向下中间鼓起）形带原因？A：主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。Q：为什么带出现拖尾现象？A：主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。处理办法：加样前离心；选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂；电泳缓冲液时间过长，重新配制；降低凝胶浓度。Q：为什么带出现纹理现象？A：主要是样品不溶性颗粒引起的。处理办法：加样前离心；加适量样品促溶剂。,Q：什么是“鬼带”，如何处理？A：“鬼带”就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时，常会出现在泳道顶端（有时在浓缩胶中）的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀，主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性，致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其分子量要比目标条带大，有时不能进入分离胶。但它却于目标条带有相同的免疫学活性，在WB反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。处理办法：在加热煮沸后，再添加适量的DTT或Beta巯基乙醇，以补充不足的还原剂；或可加适量EDTA来阻止还原剂的氧化。Q：为什么溴酚蓝不能起到指示作用？A：我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底，但蛋白质却还未跑下来的现象。主要与缓冲液和分离胶的浓度有关。处理办法：更换正确pH值的Buffer；降低分离胶的浓度。Q：为什么电泳的条带很粗？A：电泳中条带很粗是常见的事，主要是未浓