《蛋白互作研究方法》PPT课件

蛋白质相互作用研究方法,王心宇,CollegeofLifeSciences,1研究蛋白质相互作用的意义随着生命现象的研究逐渐由获取基因序列信息转向研究基因功能,一门新的学科蛋白质组学proteomics应运而生。蛋白质组是一个在空间和时间上动态变化的整体,其功能往往是通过蛋白质之间或与核酸之间相互作用而表现出来的,这种相互作用存在于机体每个细胞的生命活动过程中,相互交叉形成网络,构成细胞中一系列重要生理活动的基础。因此,对于蛋白质相互作用interactome的研究就成为蛋白质组学中最主要研究内容之一。,2蛋白质相互作用常用研究方法1酵母双杂交(Yeasttwo-hybrid,Y2H)2pull-down3免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)4双分子荧光互补技术(Biomolecularfluorescencecomplementation,BiFCorSplitYFP)5Far-westernanalysis,3酵母双杂交技术3.1原理,DNA-bindingandactivatingfunctionsinatranscriptionfactormaycompriseindependentdomainsoftheprotein.,ThetwohybridtechniqueteststheabilityoftwoproteinstointeractbyincorporatingthemintohybridproteinswhereonehasaDNA-bindingdomainandtheotherhasatranscription-activatingdomain.,3.2酵母双杂交文库构建与筛选BDMatchmakerLibraryConstruction&ScreeningKits,诱饵蛋白载体构建,pGADT7-RecVectorInformation,文库构建,ConstructingADfusionlibrariesbyrecombination-mediatedcloninginyeast.,cDNAlibraryofoilseedrapelineRS-1constructedinyeast,Yeastcellsthataremating.Azygotetypicallyhasthree-lobedshape,thelobesrepresentingthetwohaploid(parental)cellsandthebuddingdiploidcells.,Libraryscreeningbymating,PositiveclonesconfirmedonSD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-a-Gal,检测特定两个蛋白是否互作,pGADT7VectorInformation,3.3膜蛋白互作研究方法基于泛素的酵母双杂交体系(mating-basedSplitubiquitinsystemmbSUS“)1）GAL4体系的缺点2)MbSUS体系,mbSUS原理,InvivocloningintombSUSvectors,GATEWAYcloningmethod,4pulldown1)原理,2)试剂盒,TheMagneGST.Pull-DownSystem,Figure1.OverviewoftheMagneGST.Pull-DownSystemprotocol.P=PreyProtein,M=MagneGST.Particle.,5免疫共沉淀Co-IP,6Far-westernanalysis,双分子荧光互补(bimolecularfluorescencecomplementation，BiFC)分析技术，利用绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein，GFP)及其突变体(YFP,CFP,BFP)的特性作为报告基因，将荧光蛋白分割成两个不具有荧光活性的分子片段，再分别与目标蛋白连接.如果两个目标蛋白因为有相互作用而靠近，就使得荧光蛋白的两个分子片段在空间上相互靠近，重新形成活性的荧光基团而发出荧光.在荧光显微镜下，就能直接观察到两目标蛋白是否具有相互作用，并且在最接近活细胞生理状态的条件下观察到其相互作用发生的时间、位置、强弱、所形成蛋白质复合体的稳定性，以及细胞信号分子对其相互作用的影响等，这些信息对研究蛋白质相互作用有一定意义。,7双分子荧光互补技术BiFC,PrincipleoftheBiFCassay,GFP的特性绿色荧光蛋白(GFP)来源于水母(Aequoreavictoria)，分子质量约为27kda，能在各种细胞中表达.受到激发时，不需要任何辅助因子，就能在活体中发出绿色荧光.1992年，Prasher等2克隆了GFP基因.随后，GFP作为一种研究基因表达和蛋白质定位的活体可遗传标记，在各种类型细胞的研究中得到了广泛的应用.,GFP的一些定点突变能明显地改变其波长性质.产生的突变体,具有产生多色光的特性，如：GFP66位的酪氨酸突变为色氨酸后成为青色荧光蛋白(cyanfluorescenceprotein，CFP)，203位的苏氨酸突变为酪氨酸后成黄色荧光蛋白(yellowfluorescenceprotein，YFP)，145位酪氨酸突变为苯丙氨酸后成蓝色荧光蛋白(bluefluorescenceprotein，BFP)3.2002年Hu等1最先报道了用BiFC技术在活细胞中观察bZIP和Rel家族蛋白的相互作用，利用的就是YFP作标记，在荧光显微镜下用525nm波长直接检测黄色荧光.,GFP及其各种突变体的片段互补特性,Visualizationofproteininteractionsinlivingplantcellsusingbimolecularfluorescencecomplementation,Detectionofproteinproteininteractionsinplantsusingbimolecularfluorescencecomplementation,DepartmentofPlantSciences,TelAvivUniversity,TelAviv69978,Israel,Confocalimagesofbimole