实验二细菌的革兰染色法、芽孢染色法.ppt

实验二细菌的革兰氏染色及芽孢染色法,一、实验目的：,1.学习并掌握革兰氏染色法和芽孢染色法。2.巩固显微镜油镜的使用技术。3.巩固无菌操作技术,二、实验原理：,1.革兰氏染色原理：革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。,二、实验原理：,主要因为两类细菌细胞壁结构和成分不同。G+菌细胞壁：肽聚糖含量高（90）、交联程度高、肽聚糖层厚、脂类含量少用乙醇不易脱色；G-菌细胞壁：肽聚糖含量低（10）、交联程度低，肽聚糖层薄、外壁层脂类含量较高用乙醇易脱色。,2.芽孢染色法原理：,二、实验原理：,芽孢是某些G+菌形成的圆形或椭圆形的休眠体，抗热性和折光性较强。芽孢的大小、形态、位置可做分类依据。,二、实验原理：,中央芽孢,末端芽孢,偏端芽孢,游离芽孢,二、实验原理：,芽孢壁厚、透性低，着色和脱色均较困难；但当用弱碱性染料（孔雀绿）在加热的情况下进行染色时，染料可进入菌体和芽孢；进入菌体的染料经水洗后可被脱色；当用对比度大、浅色的复染色剂（番红）染色后，芽孢仍保留初染剂的颜色（绿色），而菌体呈复染剂颜色（红色）。,三、实验器材,1.菌株：革兰氏染色：培养12h-16h枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）或者金黄色葡萄球菌（Staphyloccocusaureus）和培养24h大肠杆菌（Escherichiacoli）芽孢染色：培养36h的巨大芽孢杆菌（Bacillusmegaterium）或者枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）,2.染色液和试剂：革兰氏染色染色液：结晶紫、卢戈氏碘液、95%酒精、番红复染液；芽孢染色液：5%孔雀绿水溶液、0.5%番红水溶液；二甲苯、香柏油。3.器材：载玻片、接种环、试管夹、酒精灯、擦镜纸、显微镜。,三、实验器材,四、实验步骤,1.革兰氏染色：（1）涂片：涂片方法与简单染色涂片相同。（2）干燥：与简单染色法相同。（3）固定，与简单染色法相同。（4）初染：加适量结晶紫染色液染色1-2min，水洗。（5）媒染：滴加卢戈氏碘液，媒染1min，水洗。,四、实验步骤,（6）脱色：将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇脱色20-30s至流出液无色，立即水洗。（7）复染：滴加蕃红复染液复染3min，水洗。（8）干燥：将染好的涂片空气中晾干或者用吸水纸吸干。（9）镜检：镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染色反应性。,四、实验步骤,四、实验步骤,四、实验步骤,2.Schaeffer与Fulton氏芽孢染色法,（1）涂片：按常规方法将待检细菌制成薄的涂片。（2）干燥：与简单染色法相同。（3）固定，与简单染色法相同。,四、实验步骤,（4）染色：加5%孔雀绿水溶液于涂片处（染料以铺满涂片为度），用夹子夹住涂片一端，用酒精灯火焰加热至染液冒蒸汽时开始计算时间，约维持5-8min。加热过程中要随时添加染色液，切勿让标本干涸。（加热时温度不能太高）。（5）水洗：待玻片冷却后，用水轻轻地冲洗，直至流出的水中无染色液为止。,四、实验步骤,（6）复染：用蕃红水溶液染色2min。（7）水洗：（8）干燥：（9）镜检：先低倍，再高倍，最后在油镜下观察芽胞和菌体的形态。结果：芽孢呈绿色，菌体为红色。,四、实验步骤,芽孢染色结果（芽孢呈绿色，营养体呈红色）,四、实验步骤,（10）实验完毕后的处理：将浸过油的镜头按下述方法擦拭干净，a.先用擦镜纸将油镜头上的油擦去。b.用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头擦2-3次。c.再用干净的擦镜纸将镜头擦2-3次。注意擦镜头时向一个方向擦拭。看后的染色玻片用废纸将香柏油擦干净。,四、实验步骤,五、实验报告,1、给出（Staphyloccocusaureus和Escherichiacoli的形态图，并注明两菌的革兰氏染色的反应性。2.当你对一株未知菌进行革兰氏染色时，怎样能确证你的染色技术操作正确，结果可靠？3.绘图说明你所观察的Bacillusmegaterium菌体形态，芽孢的形态及着生位置。它们各呈什么颜色。4.若涂片中观察到的只是大量游离芽孢，很少看到芽孢囊和营养细胞，你认为这是什么原因？,六、注意事项,1、革兰氏染色注意事项（1）革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响，难以严格规定。（2）染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。（3）选用幼龄的细菌。G+菌培养12h-16h，E.coli培养24h。若菌龄太老，由于菌体死亡