《葡萄糖氧化酶》PPT课件

第十二章葡萄糖氧化酶,2011年5月4日高丽萍,Glucoseoxidase,GOD氧化还原酶系统命名为-D-葡萄糖：氧1-氧化还原酶，编号：EC1.1.3.4催化葡萄糖与氧反应，生成葡萄糖酸和过氧化氢。C6H12O6+O2C6H12O7+H2O2,一、发现与历史,1928年由Muller首先从黑曲霉（Aspergillusniger）的无细胞提取液中发现葡萄糖氧化酶。随后Kusai等、Pazur和Swobod-da等分别从青霉素（P.Variable）和黑曲霉中提纯葡萄糖氧化酶。其他霉菌，象米曲霉和点青霉也能产生葡萄糖氧化酶，然而在高等植物和动物体内还没有发现葡萄糖氧化酶。,早在二十世纪四十年代就开始有葡萄糖氧化酶产品出售五十年代日本获得了结晶葡萄糖氧化酶六十年代日本长赖工业公司也开始有葡萄糖氧化酶商品出售。七十年代葡萄糖氧化酶在国外应用已很广泛。在国内，1960年以后有些单位也做过不少工作，主要用于蛋白片脱糖工序中。80年代，河北省微生物研究所在葡萄糖氧化酶的制备和应用方面作了许多深入地研究，取得了突破性的进展，先后制备了诊断用的葡萄糖氧化酶、食品用葡萄糖氧化酶等多种剂型，目前已成为葡萄糖氧化酶专业化生产基地。,二、葡萄糖氧化酶催化的反应,葡萄糖氧化酶的催化反应，按条件不同有如下三种形式：在没有过氧化氢酶存在下，每克分子葡萄糖氧化酶氧化时消耗1mol氧。C6H12O6+O2C6H12O7+H2O2,在有过氧化氢酶存在下，每克分子葡萄糖氧化酶氧化时消耗0.5mol氧。C6H12O6+1/2O2C6H12O7在有乙醇和过氧化氢酶存在下，过氧化氢同时被用于乙醇的氧化作用，此时，每克分子葡萄糖氧化酶氧化时消耗1mol氧。C6H12O6+C2H5OH+O2C6H12O7+CH3CHO+H2O,三、分子组成及其作用机制,以FAD为辅基，每克分子酶含2克分子FAD，来源不同分子量不同，目前工业酶制剂主要来源于黑曲霉，分子量为16万左右；点青霉葡萄糖氧化酶，152000；尼崎青霉葡萄糖氧化酶154000；黑曲霉葡萄糖氧化酶186000。,结合在葡萄糖较深处FAD是此氧化反应的辅助因子，图中红色所指部位，葡萄糖结合的活性位点在FAD的上面，处于较深的立体结构中，图中星号位置所示。葡萄糖氧化酶像很多在细胞外发挥作用的蛋白质一样，表面被糖链覆盖，图中用绿色表示糖链。,葡萄糖氧化酶催化反应分子机制：,四、性质,高纯度葡萄糖氧化酶为淡黄色粉末。易溶于水，完全不溶于乙醚、氯仿、丁醇、吡啶、甘油、乙二醇等有机溶剂。50丙酮、66的甲醇能使其沉淀。,1.葡萄糖氧化酶的催化特异性,它对-D-吡喃葡萄糖表现出高度的专一性。羟基处在-位时酶的活力比处在-位时高约160倍。底物分子中的任何一点改变都会显著降低其氧化速率。,表7-14葡萄糖氧化酶的底物特异性,2、pH对葡萄糖氧化酶作用的影响,最适pH值5.6。在pH3.5-6.5，具有很好的稳定性。大于8或小于2，会导致酶的迅速失活。底物葡萄糖对酶活有保护作用。例如，在pH8.1和不存在葡萄糖的条件下，10分钟内酶活力损失90%；而在相同pH和存在葡萄糖的条件下，40分钟内酶活力仅损失20%。,在实际工作中的特定环境下，低pH时也可以使用葡萄糖氧化酶。例如，30时的霉菌葡萄糖氧化酶制剂在pH2.6条件下的可乐饮料和pH3.2的葡萄饮料中的酶制剂仍具有较高的稳定性（见表7-15）。尽管在该环境下葡萄糖氧化酶的反应速度较慢，但它仍能起催化作用。,表7-15葡萄糖氧化酶的相对稳定性,3温度对葡萄糖氧化酶作用的影响,葡萄糖氧化酶的作用温度范围较宽，最适作用温度为3050，葡萄糖氧化酶在低温下有很好的稳定性。固体酶制剂低温下（-15）可保存8年，0可保存2年以上，温度高于40活力下降，酶的水溶液在60保持30min，酶的活力损失80%以上。,葡萄糖氧化酶催化反应需要氧的参与，反应温度改变将导致反应体系中氧的浓度发生改变，从而影响酶活性。温度升高时，反应体系中氧的溶解度下降，这就抵消了温度升高对酶反应速度的影响。葡萄糖氧化酶催化反应具有较低Q10；在一定温度范围内（3060），温度变化对葡萄糖氧化酶活力影响不显著。酶最适作用温度和测定酶反应速度的时间有关。,4葡萄糖氧化酶的抑制剂,抑制剂：Hg2+、Ag+、对氯汞苯甲酸、苯肼等。腺嘌呤二核苷酸（FAD）对其结构有稳定作用。一些可溶性的高分子聚合物，如醋酸乙烯酯、吡咯烷酮乙烯或乙烯醇的共聚物，可明显增强酶的稳定性。甘露糖、果糖以及D-阿拉伯糖对葡萄糖氧化酶有明显的竞争性抑制作用，不宜共同使用。氰化物、一氧化碳对酶没有抑制作用。,五、葡萄糖氧化酶的活力测定,常用方法：气压法化学滴定法电极法,1、气压测定法,原理葡萄糖氧化酶催化葡萄糖和氧气反应生成葡萄糖酸和过氧化氢，在反应中消耗了一部分氧气，通过测定在一定时间内的耗氧量，即可计算酶活力。,仪器设备：瓦（华）勃氏呼吸仪,2、化学滴定法,原理：催化葡萄糖氧化生成葡萄糖酸和过氧化氢。生成的葡萄糖酸用过量的氢氧化钠滴定中和，在用标准盐酸反滴定，从而测定得到生成的葡萄糖酸的量，再计算酶活力。,3、氧电极测定法,采用氧电极测定酶促反应的耗氧量，再计算酶活力。此方法具有简单快速的特点。葡萄糖和葡萄糖氧化酶反应转化成葡萄糖酸内酯，同时铂电极检测到过氧化氢的形成，被检测样品中的葡萄糖越多形成的过氧化物就越多，电极的信号就越强。,六、葡萄糖氧化酶应用,葡萄糖氧化酶的作用：一、去葡萄糖，二、脱氧，三、杀菌，四、测定葡萄糖含量。食品工业中的应用、检测分析中的应用,1、食品工业中的应用,葡萄糖氧化酶在食品工业上有广泛：除氧保鲜去葡萄糖。适用于食品工业中许多的产品，例如啤酒、果汁、油脂、奶制品、蛋黄酱、食品罐头和饮料的除氧；鱼、虾、蟹、肉等的保鲜；蛋品加工、炸制食品的脱糖；面食品的增筋等等。,1）蛋类制品脱糖,蛋类制品：蛋白片、蛋白粉、全蛋粉等。问题：在贮藏和加工过程中出现褐变，出现小黑点，或者溶解度下降等。原因：蛋的蛋白中含有0.5%-0.6%的葡萄糖，葡萄糖的羰基与蛋白质的氨基发生反应，生成黑色或者褐色的黑蛋白的美拉德反应。,解决方法：脱糖。,方法一：接种乳酸菌进行蛋白脱糖。处理时间长，卫生条件差，产品质量不理想。,方法二：,应用葡萄糖氧化酶进行脱糖，即将适量的酶添加到蛋白液中，不断供给适量的氧气，使葡萄糖完全氧化。如何提供适量的氧气?如果通入空气和氧气，容易产生大量的泡沫，使操作无法进行。方法-分次加入适量的过氧化氢（双氧水），加入过氧化氢酶，分解过氧化氢为氧和水。氧与葡萄糖反应生成葡萄糖酸。,2）食品的除氧保鲜,食品腐败微生物氧化变质除氧含油脂食品发生氧化，如花生、奶粉、饼干、冰淇淋、油炸食品等。果蔬产品褐变，如马铃薯、苹果、梨、果酱等。肉类氧化。,除氧方法,将需要保鲜的食品放到密闭容器中，同时将葡萄糖氧化酶和葡萄糖一起放入。吸氧保鲜袋葡萄糖氧化酶直接加入：果汁、果酒和水果罐头中，防止食品的氧化和容器的氧化。（桃罐头变色！）,（1）在啤酒生产中的应用,葡萄糖氧化酶的主要作用是：除去啤酒中的溶解氧和瓶颈氧；阻止啤酒的氧化变质过程。因此，在防止老化味产生，延长啤酒保质期方面有独特的功效。经许多啤酒厂试用，啤酒中加入葡萄糖氧化酶后可将含氧量降到10g/L以下，啤酒稳定性高、口味纯正、不产生沉淀、混浊等现象。,在啤酒保鲜中的使用方法,一步法：在啤酒灌装前把葡萄糖氧化酶加到清酒罐中，根据清酒罐内啤酒的容量计算加量，建议每升啤酒中加1070个单位，亦可根据本厂产品情况，选择最适加量和适量添加亚硫酸盐以增强效果。加入清酒罐的葡萄糖氧化酶要混合均匀，最好使用输液泵边加入边搅拌。,双效法：,在硅藻土过滤工序中将亚硫酸盐加到硅藻土罐中，加量为每吨啤酒10-15克，充分混均后进行过滤。在滤液进入清酒罐前（或同时）将葡萄糖氧化酶加到清酒罐中，建议加量为每吨啤酒40ml，待葡萄糖氧化酶与啤酒充分混匀后进行灌装。,（2）在葡萄酒生产中的应用,白葡萄酒生产时，氧是大敌，所以除氧是一项非常必要的工作。葡萄皮、葡萄埂和葡萄籽中含有较高的多酚氧化酶和酚类物质，会使白葡萄酒发生严重的褐变，尤其是使用原料成熟度差或者霉变的葡萄为原料酿制葡萄酒，问题更严重。,如果在生产白葡萄酒时加入葡萄糖氧化酶过氧化氢酶，就能防止白葡萄酒的褐变和口感、味觉的变化，还可以防止色素的沉淀，延长保存期。1升葡萄酒中加入0.5-1毫升葡萄糖氧化酶（50u/ml）效果较好。注意：葡萄酒中必须有一定量的葡萄糖，如果葡萄糖含量少，除氧效果不好，葡萄糖含量能达到1克/升即可达到要求。,另一个作用：有效的降低葡萄酒的氧化还原电位，使酒液的还原能力增强，促进脂化反应地进行，增加挥发脂，使香气成分增加。,（3）减少土豆产品的非酶褐变,非酶褐变在许多土豆制品中引起的一个严重问题就是土豆制品的褐变。Maillard反应是食品褐变的主要原因，其中还原糖和氨基酸是重要的参与物。亚硫酸盐作为抗褐变剂：对人体有害，被限制使用。,安全的生物酶法：降低氨基酸的浓度是比较困难的，同时造成营养损失；而降低葡萄糖的含量，操作起来比较容易。葡萄糖氧化酶可以有效的降低土豆产品的葡萄糖含量，减少其非酶褐变。少量的葡萄糖氧化酶减少从营养的角度来说不是很重要的。,（4）在牛奶生产中的应用,葡萄糖氧化酶能够除去食品中溶解氧,起到保鲜、护色、防褐变、保护维生素C、延长食品保质期的作用。用于鲜牛奶及乳品可防止脂肪氧化，抑制微生物生长，延长保质期。氧亦能使含油食品产生恶臭和醛酮气味，加入葡萄糖氧化酶因消耗氧而保证了产品质量。,在牛奶保鲜中的使用方法,在鲜牛奶生产工艺过程的鲜牛奶经高温瞬间消毒后，当液体温度降至48时，将食品级过氧化氢按0.8添加量缓缓加入到消毒后的鲜牛奶中，边搅拌边加入，然后继续搅拌30分钟使其充分作用。在温度30时，将葡萄糖氧化酶按0.8添加量缓缓加入到上述鲜牛奶中，边搅拌边加入，并继续搅拌20分钟，然后进行灌装。,使用效果,葡萄糖氧化酶本身是一类蛋白质，可在消化道内降解为人体所需的营养成分氨基酸。乳和乳制品在储藏过程中会发生脂肪氧化，影响风味和营养。加入葡萄糖氧化酶后既有效的防止了脂肪氧化又保持了牛奶原有的风味和营养。牛奶本身的货架保存期很短，加入葡萄糖氧化酶后可有效延长保质期。,（5）果汁保鲜剂的应用,果汁在深加工过程中若发生氧化作用，其中的一些不饱和成分如不饱合脂肪酸和烯二醇类物质将会分解，使果汁品质低下。尤其是Vc等维生素类的物质的氧化会使营养大量流失。,果汁保鲜剂葡萄糖氧化酶是一种天然食品添加剂，无毒、无副作用。添加量：葡萄糖1g/L，葡萄糖氧化酶20mg/L。主要作用：除去果汁中溶解氧，阻止果汁的氧化变质过程，此保鲜剂在果汁护色、防褐变、保护维生素C和延长保质期方面具有独特功效。,使用方法,在生产时可分二次加入。第一次在压榨果汁时，水果破碎后立即加入，一面加一面搅拌，加量为果汁量的0.15。第二次在果汁已处理好，罐装前加入，加量仍为果汁量的0.15。加入后搅匀，搅匀后立即罐装，罐装成瓶后要静置分钟，静置期间温度控制在，最好在，静置后已把溶解氧除去即可灭菌。,（6）防止虾肉变色,虾类含水77%，蛋白质20.6%，使其在加工储藏、运输及销售过程中很容易腐败变质，严重影响经济价值和营养价值。传统的保鲜方法是采用低温保存，但由于虾类自身存在的多酚氧化酶在虾类冷冻、冰藏和解冻期间仍然保持着活性，致使虾类食品都难以避免地发生褐变，保鲜、防褐变是非常重要。,使用方法,如果将虾肉在葡萄糖氧化酶过氧化氢酶溶液中浸泡一下或者将酶液加到包装的盐水中，就能阻止虾肉颜色的改变和防止哈败的产生。采用葡萄糖氧化酶保鲜的虾肉食品，冷藏、冻藏都能保持二级鲜度，色泽、气味和弹性保持良好。,（7）速冻肉食品保鲜,嫩度是指人对肉入口后咀嚼过程中的感受。系水力是指当肌肉受到外力作用如加压、加热、冷冻、切碎时保持水分的能力。系水力直接影响肉的颜色、风味、嫩度和营养价值，系水力高，肉表现为多汁、鲜嫩和表面干爽；系水力低，则肉表面水分渗出，可溶性营养成分和风味损失严重，肌肉干硬，肉质下降。脂肪的含量、化学状态都对肉品的系水力有直接的影响从而影响肉品的整体嫩度。,冷冻肉品放置一段时间后，脂肪组织发生氧化反应，以至变质，都会降低该产品的系水力，造成肉品鲜嫩可口度的直接下降。冷冻肉品加入葡萄糖氧化酶后，可以防止有效降低肉品脂肪和胆固醇的氧化，维持肌肉颜色和系水力，使肉品的鲜嫩可口度再经过冷冻保藏依旧可以得到保持。,使用方法,在肉品处理加工时加入即可，用量建议为5ml/kg,也可根据不同加工工艺增减。,油水乳化后的食品乳状液如蛋黄酱，在加工过程中引入了约占总体积1020%的空气，尽管已控制金属离子污染，使用螯合剂，然而货架寿命仍然因为受包藏的氧的作用而显著缩短。保藏期间的质量下降主要表现为颜色减褪和蛤败，并失去乳化性。在包装蛋黄酱的密闭容器中适量添加葡萄糖氧化酶过氧化氢酶体系以防止其在贮藏期间的变质。,（8）稳定食品乳状液的质量,表7-17葡萄糖氧化酶过氧化氢酶处理对蛋黄酱稳定性的影响,（9）防止马口铁罐壁氧化腐蚀,罐头生产虽然采用抽真空封罐，但罐头顶隙仍有氧气残留，特别是酸性介质，腐蚀罐壁，形成氧化圈，影响罐内食品的风味。在罐头中应用葡萄糖氧化酶，可以减轻和防止氧化圈和罐内的溶锡。在罐装啤酒的情况下，也能减少马口铁罐壁的氧化腐蚀和铁锡等重金属离子的溶出，保持其原有风味。,3）杀菌,由于葡萄糖氧化酶能去除氧，所以能防止好气菌的生长繁殖；同时由于产生过氧化氢，也可起到杀菌的作用。因此葡萄糖氧化酶可用于在特殊情况下防止微生物的繁殖。,2、检测分析中的应用,血液、尿液、发酵液等样品中葡萄糖含量的测定。糖尿病是一种全世界范围内的疾病，影响着数百万人的健康，幸运的是，通过饮食的控制和医药的治疗，糖尿病的很多并发症已经被控制住了。正常人空腹血清葡萄糖为3.89-6.11mmo/L(70一110mg/dl)。血液中葡萄糖含量的测定试进行糖尿病检测的一个必需的步骤，因为如果葡萄含量过高会使身体正常功能受到影响。葡萄糖氧化酶能够快速、简便的检测葡萄糖的含量，而且成本较低。,测糖仪（一）,葡萄糖氧化酶是用来检测血液中葡萄糖含量的生物传感器的核心部分。这些传感器的核心技术是利用葡萄糖氧化酶把不容易进行测定的葡萄糖