一种胶原蛋白寡肽体外透皮吸收性能研究VIP

第30卷第1期2011年3N成都大学学报自然科学版JOURNALOFCHENGDUUNIVERSITYNATURALSCIENCEEDITIONVL0L3ONO1MAR2O11文章编号10045422201101000803一种胶原蛋白寡肽体外透皮吸收性能研究宋芹，陈封政，颜军，郭晓强，邬晓勇，苟小军成都大学中药化学实验室，四川成都610106摘要为研究胶原蛋白寡肽的体外透皮吸收性能，采用体外透皮实验模型考察胶原蛋白寡肽平均分子量920DA，其中寡肽约占50，三肽约占12对小鼠皮肤的透皮吸收性结果表明，胶原寡肽24H的累积渗透量为11603CII】2，体外渗透过程符合零级动力学方程，Q41574T16458，R0997，表现出良好的透皮吸收性能关键词I胶原蛋白；寡肽；透皮吸收中图分类号TS59文献标识码AO引言胶原蛋白COLLAGEN称胶原，是真皮的主要组成成分由于胶原蛋白分子是由3条多肽链构成3股螺旋结构的蛋白质，能维持皮肤张力和弹性，且分子中含有大量的酰胺基团和羟基，具有较强的吸湿性，从而使皮肤保持饱满充盈|1随着人们年龄的增长，真皮内的胶原发生降解和老化，皮肤变得干燥并出现皱纹为防止皮肤衰老，有学者研究通过补充胶原蛋白来达到延缓皮肤衰老的进程，但由于胶原蛋白分子量较大，无法实现透皮吸收因此，人们开始利用生物酶技术将胶原蛋白水解成胶原寡肽或者氨基酸4J，因其分子量小，与人体皮肤胶原结构相似，并具有良好的生物相容性，因而被广泛用作化妆品的原料或添加剂B本研究拟采用酶法提取胶原蛋白寡肽，用单室扩散池技术，研究并评价寡肽对离体鼠皮的透过性能，同时，通过计算胶原蛋白寡肽对小鼠皮肤的累积渗透量、透皮速率，进而研究寡肽的离体透皮吸收性能1材料、试剂与仪器11材料与试剂实验所用材料与试剂包括罗非鱼干燥鱼鳞海南水产品市场；胞嘧啶核苷CYTIDINE和光纯药工业株式会社，LOTTCH3764，细胞色素CCYTOCHROMEC和光纯药工业株式会社，LOTPKN7103，VITAMINB1和光纯药工业株式会社，LOLCL20O，酪蛋白和光纯药工业株式会社，LOTWAGT059，三氯乙酸、羟脯氨酸、氯胺T、柠檬酸、氢氧化钠、醋酸钠、正丙醇、对二甲氨基苯甲高氯酸、异丙醇、硫酸等试剂均为分析纯12仪器实验所用仪器包括LC。9ASHIMADZUCR7A高效液相色谱仪日本岛津公司，UV一1601型紫外分光光度计日本岛津公司，METIZERAE100型电子天平瑞士METII,ER公司，恒温磁力搅拌器、单室扩散池、日立L8800型氨基酸分析仪日本日立株式会社，离子交换树脂柱46MLTL60MM，2622SC型日本日立株式会社2方法与结果21胶原蛋白寡肽COLLAGENPEPTID，CP制备取罗非鱼鱼鳞经HC1脱钙后，酶解，得平均分子量为9173DA的胶原蛋白寡肽，取CP适量，溶解于09NACL溶液中，制成5MEME溶液22凝胶柱色谱法测定分子量分布在色谱柱SUPERDEXPEPTIDE10300GL、柱温25C【、流速05MUMIN、进样量50，以002MPHOSPHATEBUFFER，025MNAC1，PH值72为流动相的色谱条件下，于214RLIN波长处测定样品或标准品细胞色素CCYTOCHROMEC，MW12500DA，025MRME、维他命B12VITAMINB12，MW1355DA，0025MEME及胞嘧啶核苷CYTIDINE，MW246DA，0025MRME的保留时间，以各标准品峰的保留时间RNIN收稿日期20101218作者简介宋芹1982一，女，博士，讲师，从事天然产物研究与开发第1期宋芹，等一种胶原蛋白寡肽体外透皮吸收性能研究9为横坐标，分子量的对数1OGMW为纵坐标，绘制标准工作曲线，得线性回归方程，Y一00743X56301，R0998同时，按下式计算平均分子量，MWMW1口LMW212MW3A3MW0式中，MW为色谱图中第RZ个峰的分子量DA，2N为色谱图中第N个峰占总峰面积的百分数胶原蛋白寡肽平均分子量约为920DA，10个氨基酸以下的寡肽约占50，三肽约占12样品GPC色谱图如图1所示荨至量晕0宝孽I；II蕈；霉；拿图1样品GPC色谱图23氨基酸组成及含量分析在实验中，我们采用日立L8800型氨基酸分析仪，以离子交换树脂柱46RLLLTL601TI1TI。2622SC型为分离柱，在缓冲液流速为04MI_MIN，柱压为773MPA，茚三酮流速为035MLMIN，柱压为0708MPA，柱温为54，反应器温度为1360，氮气压力为20KPA条件下梯度洗脱，并分别于440NN、570NRLL波长下检测吸收峰，以此对胶原蛋白寡肽氨基酸组成与含量进行分析，结果见图2、3与表I羟脯氨酸是胶原蛋白特有氨基酸之一，由分析结果可见，该胶原蛋白寡肽中羟脯氨酸的含量占总氨酸含量的9左右，盥J童一盖三盐立袁譬盘LL毒，JY上O21ELLL2口2428F,TENTION1LFJ1CM图2罗非鱼鱼鳞胶原蛋白氮基酸色谱图570NMOIT2IIST，IEEENIOFI下ILLIC，T1IRL图3罗非鱼鱼鳞胶原蛋白氮基酸色谱图44OHM表1氨基酸组成与含量表往表目人体必须氨基鳆，辩表人体半必须氨基酸24胶原蛋白寡肽体外透皮速率测定241离体鼠皮制备实验用昆明种小鼠2O一22G6只，雌雄各半，处死，除去腹部毛发，然后剥离去毛发部位皮肤，除去脂肪和筋络，用蒸馏水反复冲洗鼠皮洗净后用生理盐水冲洗，再用10甘油液处理，防止贮存时形成冰晶，并置于一20低温冰箱中贮存备用7D内用完242实验装置实验装置中，扩散池有效扩散面积20CRN2，接受池体积14ML，定制搅拌子长度14CM，接受液为09的NAC1溶液243样品液制备取出贮备鼠皮，解冻，生理盐水洗净，将其夹在10成都大学学报自然科学版第30卷接受室与供给室之间，贴药面朝向供给室，皮肤面朝向接受室调整水浴系统温度为375CC，搅拌速度为100RMIN，在接受室中加人预温37的09NAC1溶液，排尽气泡为降低干扰，在不给药的情况下，先将鼠皮内层表面与接受液接触，更换全部接受液，再将胶原蛋白寡肽溶液注入供给室紧贴于鼠皮肤上分别于第1、24、6、8、12、24H用注射器吸取全部接受液作为样品液，以进行胶原蛋白寡肽透皮量的测定同时，将接受室补满等温新鲜09NAC1溶液，以保持漏槽状态最后，将收集的7个时间段的样品液挥干备用244羟脯氨酸标准曲线羟脯氨酸是胶原蛋白的一种特性蛋白质，胶原蛋白含量的确定可以羟脯氨酸的含量换算，胶原蛋白含量等于羟脯氨酸含量乘以系数111通过氨基酸成分分析得出，即羟脯氨酸含量为占总氨酸含量的9左右通过0、125、25、50、100TGML5种不同浓度的羟脯氨酸标准样品经氧化脱羧反应生成吡咯，以对二甲氨基苯甲醛显色，测定558NIN处的吸光度，并以浓度GML为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准工作曲线，得回归方程为，Y00141X00341R0999结果表明，羟脯氨酸含量在0100TGML之间与吸光度呈良好的线性关系0204O6080100120浓度，1,TML图4羟脯氨酸标准曲线图245样品含量测定首先，取备时间段所取样品于试管中，6O水浴挥干溶剂，加人浓度为6MOLL的HC1溶液1ML，密封试管，于110，24H水解样品，使羟脯氨酸充分游离冷却至室温后，在减压条件下，7O水浴加热，蒸干样品液体，充分除去HCI然后，往试管中加入5ML蒸馏水，使残留在管壁上的样品充分溶解，取其中溶液05ML，加蒸馏水稀释至10ML，经氧化脱羧反应生成吡咯，以对二甲氨基苯甲醛显色，钡4定558NLN处的吸光度A值，代人标准曲线，计算胶原蛋白含量，结果见表2表2样品中胶原蛩白含量的测定样品1H2H4H6H8H12H24H胶原含量UG36721684108614573084189810326最后，由累积渗透量公式计算Q值，NC】C2CV一一丁一式中，Q为T时问的累积渗透量T,GCM，C为第孔个取样点的浓度BTGL，A为渗透面积本实验中仪器释放面积为20C，为接受液的总体积14ML结果见表3表3累积渗透量的测定样品1H2H4H6H8HL2H24H景璺譬1836267832213949549164401L603CNR由表3数据得曲线方程，Q41574T16458R0997由该曲线方程可知，胶原蛋白寡肽的体外渗透过程符合零级动力学方程，且表现出良好的透皮性能3讨论本实验采用罗非鱼鱼鳞水解胶原寡肽，其平均分子量为920DA，其中1O个氨基酸以下的寡肽约占50，三肽约占12通过体外透皮吸收实验可以确定，分子量较小的寡肽能够通过皮肤直接吸收，并随透皮时间逐渐累积，呈现线性递增，此也说明小分子寡肽具有良好的透皮吸收性能，能透过皮肤的角质层、表皮层到达真皮层由于胶原寡肽具有较好的生物亲和性与保湿作用，其在滋养肌肤、防皱养颜、延缓衰老等护肤品研制方面具有较好的应用开发前景参考文献1刘玮，张怀亮皮肤科学与化妆品功效评价M北京化学工业出版社，20052程艳，祁彦，王超，等保湿化妆品功效评价与发展展望J香料香精化妆品，2006，34331343陈龙，陈栋梁，杨国燕，等鱼胶原肽保温功能的比较研究J中国美容医学，2008，1745865894李贺，刘白玲，陈华林，等酶法提取猪皮胶原及其结构表征J中国皮革2OO2，312314165陈冬英胶原蛋白与化妆品J香料香精化妆品，2001，29618一L9下转第14页14成都大学学报自然科学版第3O卷SYNTHESISANDPROPERTIES0FOCTANU0R0PENTYLALCOHOLORGANICPHOSPHATEQIULU，MAOFENGYIN，SUNMINGBINGSCHOOLOFMATERIALSANDCHEMICALENGINEERING，SICHUANUNIVERSITYOFSCIENCEANDENGINEERING，ZIGONG643000，CHINAABSTRACTOETAFLUOMPENTYLALCOHOLORGANICPHOSPHATEISAKINDOFNEWSURFACTANTOETAFLUOMPENTYLALCOHOLORGANICPHOSPHATEWHICHISTHERAMIFICATIONOF2，2，3，3TETRAFLUOM一1一PROPANOLANDPHOSPHORUSPENTOXIDEWERECHOSENASRAWMATERIALANDTHEEFFECTSOFREACTIONTIME，REACTIONTEMPERATUREANDMOLARRATIOOFMATERIALONESTERIFICATIONWERESTUDIEDITISCONCLUDEDTHATTHEOPTIMUMREACTIONCONDITIONOFESTERIFIEATIONISASFOLLOWSTHEMOLERATIOOFOETAFLUOMPENTYLALCOHOLORGANICPHOSPHATETOPHOSPHORUSPENTOXIDEISCLOSETO281REACTIONTEMPERATUREISAT60C【ANDTHEBESTREACTIONTIMEIS3HPRODUCTIONRATEOFMONOESTERANDDIESTERIS448AND326RESPEETIVELYTHECMCIS52910MOLL，ANDSURFACETENSIONIS2407MNMAFTERDETERMINATIONOFPROPERTYOFPRODUCTSKEYWORDSFLUORINECONTAININGSURFAETANT；ESTERIFICATION；PHOSPHE上接第1O页PERCUTANEOUSEXPERIMENTALSTUDYONCOLLAGENOLIGOPEPTIDESONGQIN，CHENFENGZHENG，YANJUN，GUOXIAOQIANG，删XIAOYONG，GOUXIAOJUNCHEMISTAYLABORATORYOFTRADITIONALCHINEMEDICINE，CHENGDUUNIVERSITY，CHENGDU610106，CHINAABSTRACTTOSTUDYTHEPERCUTANEOUSABSORPTIONOFTHECOLLAGENOLIGOPEPTIDETOEXSOMATIZERATSKIN，VITROPENETRATIONMODELWASDESIGNEDTOINVESTIGATEPEREUTANEOUSABSORPTIONOFCOLLAGENOLIGOPEPTIDETHEAVERAGEMOLECULARWEIGHTOFPEPFIDIS920DA，50OFOLIGOPEPTIDE，12OFTRIPEPTIDETORATSKINTHERESULTSOFTHEEXPERIMENTSHOWTHATTHEAC