抗脑缺血药物研究方法

1,实验药理学抗脑缺血药物研究方法,温州医学院药理学教研室陈醒言,2,概述脑缺血性疾病的临床危害,脑血管疾病中最常见的临床表现（脑缺血、脑出血）脑血管疾病高死亡率（死亡总人数的11.3%，仅次于肿瘤、心肌梗死）严重危害人类健康的疾病（1/3死亡，后遗症危害大）,3,脑缺血的发病机理,脑血管阻力增加脑血栓形成脑供血不足,4,整体动物脑缺血实验模型,1.整体动物脑缺血模型的制备要求实现脑缺血与临床病因相近或相同可操作，易实现具有明确的检测指标易于观察药物作用,5,抗脑缺血药物研究方法,整体动物研究方法根据脑缺血的临床表现，建立脑缺血动物实验模型，用于观察药物对脑缺血的影响正常动物模型（测定药物作用，如：脑血流量的变化，运动状态的影响，基本生理功能的影响，作用机理的探讨等）实验动物病理模型（脑缺血动物模型）其他(转基因或基因敲除模型等),6,整体动物脑缺血实验模型,1.全脑完全缺血实验方法（1）蒙古沙土鼠颈动脉阻断的脑缺血模型 蒙古沙土鼠(Meriones unguiculatus) 缺少前交通支和后交通支动脉，导致 Willis 环的不完全，夹闭双侧颈总动脉可引起蒙古沙土鼠大脑两半球的缺血，海马对缺血缺氧尤为敏感，通常缺血5min，然后再灌注，即可产生迟发性海马CA1锥体神经元损伤或死亡.这一病理模型可以较好的模拟人脑血液循环障碍。 本法的优点是方法简便，以至应用较广。其缺点是易诱发癫痫，在实验室要剔除惊厥动物。本模型主要研究病理机制及药物对其影响。,模型制备,蒙古沙土鼠， 不拘，体重5070g，1戊巴比妥钠（40mg.kg-1，ip）麻醉。游离双测颈总动脉，应用无创微动脉夹分别夹闭双测颈总动脉3，5min后松开动脉恢复脑血流灌注。同时监测脑电图，将1min内脑电图未成等电位的沙土鼠从实验中剔除。整个实验过程中将动物置于流动空气浴箱中，维持动物鼓膜温度在（370.3）。,7,8,（2）大鼠缺氧耐受实验,脑的电活动依赖于持续的能量供应，吸入氮气可以导致实验动物的缺氧。明显的缺氧可以降低脑代谢，引起脑电活动的抑制。这一实验主要通过观察对缺氧的耐受和脑电图（EEG的恢复这两个指标，研究化合物抗脑缺血引起脑电抑制的作用。操作步骤 雄性SD或中风倾向大鼠，i.p.环己巴比妥钠麻醉。硬脑膜外植入 2 电极记录脑电图（EEG），参考电极置于头顶前额骨。在腹腔注射待测化合物后，将动物置于缺氧室中，以Hellige 记录仪记录 EEG 和 ECG。通过吸入氮气(1200 l/h)造成低氧状态。当 EEG呈等电位时, 停止吸入氮气而让动物吸入空气，持续记录直至 EEG 恢复。,9,（3）小鼠缺氧耐受实验,A、小鼠断头法。 由于缺氧引起呼吸动作存在，这种呼吸动作的持续时间可以间接反映脑能量储存和脑缺氧能力。B、亚硝酸钠法。 静脉注射亚硝酸钠溶液，导致血液中氧耗竭，而引起动物死亡，单位体重亚硝酸钠致死量可以反映动物的耐缺氧能力。C、窒息法。 观察小鼠密闭状态下，窒息致死需要的时间。,10,（4）大鼠四动脉结扎法,结扎大鼠双侧颈总动脉，双侧锥动脉，造成大鼠全脑缺血。主要表现为前脑缺血。操作步骤 雄性SD或westar大鼠，在麻醉下，分离双测颈总动脉并置套扣待用，然后将动物固定在立体定位仪的耳杆上，将头向下30度，尾部用橡皮带绑扎，给以一定拉力，使动物颈部脊髓伸展，使椎板处于水平位置，这样更便于观察和电凝翼状孔下的椎动脉。分离椎旁肌，暴露第一颈椎的翼状孔，用单极烧灼针垂直插入并电凝。24h后动物在清醒状态下，操纵套扣，夹闭双侧颈总动脉形成全脑缺血，一定时间后放开夹子使脑血流再灌。,11,（4） 大鼠四血管阻断前脑缺血模型,四动脉阻断后约3/4大鼠翻正反射消失，23min内EEG成等电位，直到再灌后才恢复。只有这样的动物才被认为使全脑缺血。该动物仍有自主呼吸及角膜反射，说明脑干无明显缺血。缺血10min、20min或30min的大鼠惊厥比例分别为0、8和20（在24h内），或40（72h内）。为便于分析结果，一般将发生惊厥的动物剔除。,12,本法优点：简便易掌握；可在清醒状态下应用；可产生严重的前脑缺血并可进行重灌注实验。其缺点为：成功率较低，一般在50左右；由于椎动脉与脊髓前动脉间可能有交通支，所以少数动物缺血深度不够；可能由于急性脑干缺血，少数动物在脑缺血后骤然死亡；个体差异大，模型稳定性差。,13,3.全脑部分缺血实验方法,（1）大鼠前脑缺血Smith 等 (1984)描述了通过暂时阻断大鼠双侧颈总动脉和通过放血使血压降至 40 mm Hg，造成前脑缺血的模型。操作步骤夹闭双侧颈总动脉并放血至血压为40mmHg，造成前脑缺血。缺血10 min 开放颈总动脉，输注代血浆迅速恢复血压至正常。,14,（2）小鼠颈动脉结扎法,夹闭双侧颈总动脉，造成前脑缺血。缺血10 min 开放颈总动脉。,15,4.局灶性脑缺血动物模型（1）大鼠大脑中动脉阻断（MCAO）大鼠大脑中动脉 (MCA) 阻断模型广泛用于评价多种化合物在脑缺血过程中的神经保护作用。 A. 化学梗塞法 B. 电烧灼法 C. 插线法,16,4.局灶性脑缺血动物模型,1.m.a. 9.Basilar a. 2.Sup. Cerebellar.a. 10.Lingual a.3.Mastoid Bulla 11.Ext. max. a. 4.Pterygopal. a. 12.Sup. Thyr. a.5.Ant. Cerebral. a. 13.Occip. a. 6.Mid. Cerebral a. 14.Ext. carotid a.7.Post. Cerebral a. 15.Com. Carotid a.8.Int. carotid a.Diagram of cerebrovascular anatony in rats,17,4.局灶性脑缺血动物模型,缺血部位对大鼠脑梗死发生率的影响,18,（2）光化学法引起的大鼠局灶性脑缺血模型,目的与原理在给大鼠注射染料 Rose Bengal之后，用光导纤维通过颅骨给予强的绿光照射，可导致大鼠局灶性脑缺血。可以采用多种指标研究脑梗塞的情况，如梗塞体积，局部脑血流和葡萄糖的利用。操作步骤 大鼠正中切开头皮，暴露右侧颅骨，用氙灯发射强绿光， 经一滤波器和一滤热器直接引导至颅骨前囟点照射15 min。本实验技术是无创性的，因此在缺血期间不用监测血气和血压，但需要控制肛温和血浆葡萄糖的水平。,19,5.弥漫性脑缺血动物模型,微球颗粒动脉注射法自身血凝集块注射法,20,6.脑缺血再灌注动物模型,（1 ）小鼠（2）大鼠 （3）其他动物,21,整体动物脑缺血实验模型选择,研究目的：符合解决问题的需要，动物特点：模型制备条件检测内容：适合检测要求给药要求：适合给药特点其他条件：,22,整体动物脑缺血模型检测方法,1.体外检测法（ex vivo）细胞功能线粒体功能细胞膜功能,23,整体动物脑缺血模型检测方法,2.形态学观察法缺血区显色大体观察水肿程度测定细胞亚细胞形态观察放免、免疫组化实验法原位杂交实验,24,2.形态学观察法 缺血区显色大体观察,处死后迅速取脑，-10 冷冻 10 min，将前脑经冠状切面切成8片，TTC （tetrazolium chloride emulsion)染色，随机选择不被TTC染色的8个冠状脑区切面，测定大脑半球、皮层和尾状核的缺血面积。,25,2.形态学观察法,缺血区显色大体观察,26,3.行为学检测法,运动功能意识评价： （03级评分） 0: 正常活动；1: 自发活动+/-； 2：触觉刺激不能唤醒; 3：疼痛刺激不能唤醒，无自发活动。（在处死前，以03级进行神经行为学的评分） 运动能力评价： （03级评分） 0: 未观察到行为缺陷; 1: 前肢弯曲; 2:抵抗侧推力量下降，但无旋转；3: 与2相似，但有旋转。,27,3.行为学检测法,运动功能斜板法转轮法运动轨迹法引体法游泳法,28,3.行为学检测法,学习记忆功能被动回避实验(跳台实验，避暗实验)主动回避实验(穿梭实验)迷宫法(水迷宫，多臂迷宫，MORRIS实验)探索实验(孔板法),29,整体动物脑出血实验模型,脑卒中实验法自发性易卒中高血压大鼠脑室自身血注射法,30,组织器官水平研究方法,根据脑缺血引起的组织器官功能变化，研究改善脑组织或其他相关组织功能的药物扩血管药物抗血小板抗凝血药物血栓溶解药改善组织机能状态的药物其他(神经细胞保护剂，机体功能调节药等),31,细胞水平研究方法,根据脑缺血的细胞生物学表现，研究抗脑缺血药物或脑损伤保护药物谷氨酸释放抑制剂腺苷转运抑制剂白细胞黏附抑制剂抗血小板药物其他(抗凋亡药，GABA增强剂等),32,分子水平研究方法,根据脑缺血的病理机制，研究抗脑缺血药物或脑损伤保护药物钙通道配基结合实验自由基清除及抗氧化实验谷氨酸受体结合实验PAF受体结合实验等NO合酶活性实验其他,33,其他研究方法,根据脑缺血机理研究进展，应用多种方法研究抗脑缺血的药物分子生物学研究方法基因组蛋白质组学研究方法临床研究方法多学科研究方法,34,脑缺血的致病机理,（继发于脑供血不足的脑损伤）脑能量代谢兴奋性氨基酸炎症反应（PAF，IL-1，IL-8）自由基及过氧化细胞内钙离子超载细胞凋亡其他,35,脑缺血模型应用总体思路,动物模型 细胞模型 药物干预 行为学 形态学 机制研究 （代偿作用、继发反应） （药物作用分析）,36,抗脑缺血的常用药物,改善脑供血的药物脑血管扩张药物（钙通道阻滞剂）溶栓药物（尿激酶 UK，链激酶 SP，重组组织型纤溶酶原激活剂 rt-PA，蛇毒）抗凝药物和抗血小板药物（LMWH；阿司匹林等）,37,脑功能