GB 1886.174-2016 食品安全国家标准 食品添加剂 食品工业用酶制剂

016食品安全国家标准食品添加剂 016 前 言本标准代替010食品安全国家标准 食品工业用酶制剂,006食品添加剂 糖化酶制剂,006食品添加剂 009食品添加剂 本标准与010相比,主要变化如下:增加了酶活力的术语和定义;增加了产品分类、理化要求;在附录中给出了部分酶制剂的酶活力测定方法。0161 食品安全国家标准食品添加剂 食品工业用酶制剂1 范围本标准适用于 品工业用酶制剂由动物或植物的可食或非可食部分直接提取,或由传统或通过基因修饰的微生物(包括但不限于细菌、放线菌、真菌菌种)发酵、提取制得,用于食品加工,具有特殊催化功能的生物制品。注:商品化的酶制剂产品允许加入易于产品贮存、使用的配料成分。活力酶在一定条件下催化某一特定反应的能力,即为酶活力,是表达酶制剂产品的一个特征性专属指标。菌活性抑制或杀灭微生物的能力。3 产品分类按产品形态分为固体剂型和液体剂型两类。4 于生产酶制剂的原料必须符合良好生产规范或相关要求,在正常使用条件下不应对最终食品产生有害健康的残留污染。源于动物的酶制剂,其动物组织必须符合肉类检疫要求。源于植物的酶制剂,其植物组织不得霉变。微生物生产菌种应进行分类学和(或)遗传学的鉴定,并应符合有关规定。菌种的保藏方法和条件应保证发酵批次之间的稳定性和可重复性。化指标产品酶活力在标示值的85%115%。0162 注:本标准附录业可按相应标准中给出的或企业规定的方法测定。染物限量污染物限量应符合表1的规定。表1 污染物限量项 目指 标检验方法铅(mg/(mg/生物指标微生物指标应符合表2的规定。表2 微生物指标项 目指 标检验方法菌落总数/(08沙门氏菌(25基因重组技术得到的微生物生产的酶制剂不应检出生产菌。菌活性微生物来源的酶制剂不得检出抗菌活性,抗菌活性按食品安全国家标准 微生物源酶制剂抗菌活性的测定执行。0163 附 录 般规定本标准所用试剂和水,在没有注明其他要求时,均指分析纯试剂和6682规定的三级水。试验中所用标准溶液、杂质标准溶液、制剂及制品,在没有注明其他要求时,均按601、602和603的规定制备。试验中所用溶液在未注明用何种溶剂配制时,均指水溶液。葡萄糖苷键,将淀粉链切断成为短链糊精和少量麦芽糖和葡萄糖,使淀粉黏度迅速下降的酶。温1于60、为1个酶活力单位,以U/g(U/示。高温1于70、为1个酶活力单位,以U/g(U/示。理葡萄糖苷键随机切断成长短不一的短链糊精、少量麦芽糖和葡萄糖,而使淀粉对碘呈蓝紫色的特性反应逐渐消失,呈现棕红色,其颜色消失的速度与酶活性有关,据此可通过反应后的吸光度计算酶活力。化钾。碘液:少量水使碘完全溶解,定容至500存于棕色瓶中。碘液:存于棕色瓶中。溶性淀粉溶液(20g/L):溶性淀粉(以绝干计)于烧杯中,用少量水调成浆状物,边搅拌边缓缓加入70后用水分次冲洗装淀粉的烧杯,洗液倒入其中,搅拌加热至完全透明,冷却定容至100液现配现用。注:可溶性淀粉应采用酶制剂分析专用淀粉。酸缓冲液(262O),用水溶解并定容至10000164 酸溶液c(。光光度计。温水浴:精度动移液器。管:2500表。测酶液的制备称取试样1g2g(少量磷酸缓冲液充分溶解,将上清液小心倾入容量瓶中,若有剩余残渣,再加少量磷酸缓冲液充分研磨,最终样品全部移入容量瓶中,用磷酸缓冲液定容至刻度,摇匀。用四层纱布过滤,滤液待用。注:测耐高温5U/定a) 匀后,置于60耐高温恒温水浴中预热8b) 即计时,摇匀,准确反应5c) 匀,66010)。根据吸光度查表附录B,求得测试酶液的浓度。温位为U/g,按式(算:X1=cn(中:c测试酶样浓度,单位为U/g;n样品的稀释倍数。所得结果表示至整数。试验结果以平行测定结果的算术平均值为准。在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不大于算术平均值的5%。高温U/式(算:X2=cn(中:c测试酶样的浓度,单位为U/g;n样品的稀释倍数;0165 根据酶活力定义计算的换算系数。所得结果表示至整数。试验结果以平行测定结果的算术平均值为准。在重复性条件下获得的两次独立测定结果的相对误差不得超过5%。糖淀粉酶(淀粉葡糖苷酶)活力的测定(黑曲霉及其变异株来源)糖淀粉酶(淀粉葡糖苷酶)以淀粉为底物,在一定条件下从淀粉的非还原性末端开始水解、葡萄糖苷键产生葡萄糖的淀粉葡萄糖苷酶。糖淀粉酶(淀粉葡糖苷酶)活力1为一个酶活力单位,以U/U/g)表示。乙酸称取乙酸钠(水溶解并定容至1000述缓冲溶液的使用酸度计加以校正。硫代硫酸钠标准滴定溶液。碘标准溶液。氢氧化钠溶液。硫酸溶液:吸取分析纯浓硫酸(却后,用水定容至100匀。00g/取氢氧化钠20g,用水溶解,并定容至1000g/取可溶性淀粉2g后用少量水调匀,缓缓倾入已沸腾的水中,煮沸、搅拌直至透明,冷却,用水定容至100溶液需当天配制。注:可溶性淀粉应采用酶制剂分析专用淀粉。析天平:度计:析天平:温水浴:40续多档分配器(移液枪)。力搅拌器。体酶:使用连续多档分配器准确吸取适量酶样,移入容量瓶中,用缓冲溶液稀释至刻度,充分摇匀,待测。体酶:用50确至1少量乙酸用玻璃棒仔细捣研,将上层清液小心倾入适当的容量瓶中,在沉渣中再加入少量缓冲溶液,如此反复捣研3次0166 4次,取上清液,最后全部移入容量瓶中,用缓冲溶液定容,磁力搅拌30上清液测定。注:活力约为120U/50U/克计算。定取A、别加入可溶性淀粉溶液25匀。于40恒温水浴中预热50即记时,摇匀。在此温度下准确反应30即向A、匀,同时将两管取出,迅速用水冷却,为空白对照)。吸取上述A、别于两个碘量瓶中,加氢氧化钠溶液15加边摇匀,并于暗处放置15出。用水淋洗瓶盖,加入硫酸溶液2硫代硫酸钠标准滴定溶液滴定蓝紫色溶液,直至刚好无色为其终点,分别记录空白和样品消耗硫代硫酸钠标准滴定溶液的体积(A、B)。果计算葡糖淀粉酶制剂的酶活力位为U/g,按式(算:2.2n2512(中:A滴定空白时,消耗硫代硫酸钠标准滴定溶液的体积,单位为毫升(B滴定样品时,消耗硫代硫酸钠标准滴定溶液的体积,单位为毫升(硫代硫酸钠标准滴定溶液的准确浓度,单位为摩尔每升();g/=反应液的总体积,单位为毫升(5吸取反应液的体积;1/2折算成1n稀释倍数;2反应30算成1样品测定结果的算术平均值表示,保留3位有效数字。试验结果以平行测定结果的算术平均值为准。在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不大于算术平均值的10%。白酶能切断蛋白质分子内部的肽键,使蛋白质分子变成小分子多肽和氨基酸的酶。白酶活力蛋白酶活力以蛋白酶活力单位表示,定义为1一定温度和为1个酶活力单位,以U/g(U/示。理蛋白酶在一定的温度与解酪蛋白底物,产生含有酚基的氨基酸(如:酪氨酸、色氨酸等),0167 碱性条件下,将福林试剂还原,生成钼蓝与钨蓝,用分光光度计于波长680活力与吸光度成比例,由此可以计算产品的酶活力。林试剂:于2000酸钠(7005%磷酸50盐酸100火沸腾回流10h,取下回流冷却器,在通风橱中加入硫酸锂(0g、水509%),再微沸15除去多余的溴(冷后仍有绿色需再加溴水,再煮沸除去过量的溴),冷却,加水定容至1000匀,过滤。制得的试剂应呈金黄色,贮存于棕色瓶内。林使用溶液:一份福林试剂与二份水混合,摇匀。也可使用市售福林溶液配制。酸钠溶液():称取无水碳酸钠(水溶解并定容至1000氯乙酸():水溶解并定容至1000氧化钠溶液(20g/L):水900溶液到室温后续水定容至1000拌均匀。酸溶液:c(1。酸溶液:c(。冲溶液。以下各种缓冲溶液配制时需用 磷酸缓冲液(用于中性蛋白酶制剂)。分别称取磷酸氢二钠(2水溶解并定容至1000 乳酸钠缓冲液(用于酸性蛋白酶制剂)。取乳酸(80%90%)0%)水至900拌至均匀。容至1000 硼酸缓冲溶液(用于碱性蛋白酶制剂)。水900拌至均匀。用1氢氧化钠溶液调整容至1000蛋白溶液():称取标准酪蛋白(少量氢氧化钠溶液(若酸性蛋白酶制剂则用浓乳酸2滴3滴)湿润后,加入相应的缓冲溶液约80沸水浴中加热煮沸30不时搅拌至酪蛋白全部溶解。冷却到室温后转入100适宜的容前检查并调整溶液在冰箱内贮存,有效期为3天。使用前重新确认并调整:不同来源或批号的酪蛋白对试验结果有影响。如使用不同的酪蛋白作为底物,使用前应与以上标准酪蛋白进行结果比对。00g/精确称取预先于1051盐酸溶液60为1mg/取1mg/盐酸溶液定容至100得到100g/:除上述蛋白酶的溶解/稀释缓冲体系外,生产者和使用者还可以探讨使用其他适用的缓冲体系。析天平:外0168 温水浴锅:精度 准曲线的绘制标准曲线的绘制按如下操作:a) 做平行试验),荡均匀,置于40浴中显色20出,用分光光度计于波长6800不含酪氨酸的0管为空白,分别测定其吸光度。以吸光度氨酸的浓度制标准曲线。c) 利用回归方程,计算出当吸光度为1时的酪氨酸的量(g),即为吸光常数00范围内。如不符合,需重新配制试剂,进行试验。注:测酶液的制备称取酶样品1g2g,后用相应的缓冲液溶解并稀释到一定浓度,推荐浓度范围为酶活力10U/5U/于粉状的样品,可以用相应的缓冲液充分溶解,然后取滤液(慢速定性滤纸)稀释至适当浓度。定按如下进行测定:a) 先将酪蛋白溶液放入40温水浴中,预热5b) 按下列程序操作:试管A(空白) 试管B(酶试样,需作三个平行试样) 02 400169 匀)匀)4010 40匀)匀) 取出静置10滤(慢速定性滤纸)取出静置10滤(慢速定性滤纸) 0显色20 40显色201010草芽孢来源的中性蛋白酶制剂,除反应与显色温度为30,其他操作同上,标准曲线做同样处理。果计算从标准曲线上读出样品最终稀释液的酶活力,蛋白酶制剂的酶活力位为U/g,按式(算:10(中:由标准曲线得出的样品最终稀释液的活力,单位为U/1溶解样品所使用的容量瓶的体积,单位为毫升(4反应试剂的总体积,单位为毫升(样品的稀释倍数;样品的质量,单位为克(g);10反应时间,单位为分钟(所得结果表示至整数。试验结果以平行测定结果的算术平均值为准。在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不大于算术平均值的3%。胶酶活力的测定(黑曲霉来源)胶酶能水解果胶,生成含有还原性基团产物的酶。胶酶活力在50、11为1个酶活力单位,以U/ 原理果胶酶能水解果胶,生成的半乳糖醛酸的还原性糖醛基可用次亚碘酸法定量测定,以此来表示果胶酶的活性。01610 本方法主要用于检测果胶酶产品中多聚半乳糖醛酸酶和果胶裂解酶的活力,对于果胶酶中的果胶(甲基)酯酶不适用。0g/加水溶解,煮沸,冷却,过滤。水定容至100箱储存备用。使用时间不超过3天。注:果胶底物对试验的影响大。如使用不同来源或批号的果胶粉,应与旧批次进行对照试验。代硫酸钠标准溶液:c(。酸钠标准溶液:c(122。标准溶液:c(12。硫酸溶液:慢加入适量水中,冷却后用水定容至100匀,备用。溶性淀粉指示液(10g/L)。柠檬酸称取柠檬酸(2O)檬酸三钠(950用水定容至1000 色管:25加热装置的恒温水浴:控温精度量瓶:250定管:25 品溶液的制备用已知质量的50取1g2少量柠檬酸用玻璃棒捣研,将上清液小心倾入容量瓶中,若有剩余残渣,再加少量上述缓冲液充分研磨,最终样品全部移入容量瓶中,定容至刻度,摇匀。用四层纱布过滤,滤液待用。注:待测酶液需准确稀释至一定倍数,要时可先做预备试验。定于甲、乙两支比色管中,分别加入5于50温水浴中预热8甲管(空白)加入5乙管(样品)中加入1即摇匀,计时,准确反应30即取出,加热煮沸5却;取上述甲、乙管反应液各5确加入4匀,于暗处放置20出,加入2硫代硫酸钠标准溶液滴定至浅黄色,加淀粉指示液3滴,继续滴定至蓝色刚好消失为其终点,记录甲管、乙管反应液消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积。同时做平行样品测定。果计算果胶酶制剂的酶活力位为U/g,按式(算:n1051(01611 式中:空白消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积,单位为毫升(样品消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积,单位为毫升(硫代硫酸钠标准溶液的浓度,单位为摩尔每升();半乳糖醛酸的毫摩尔质量,单位为毫克(n稀释倍数;10反应液总体积,单位为毫升(5滴定时取反应混合物的总体积,单位为毫升(1反应时加入稀释酶液的体积,单位为毫升(反应时间,单位为小时(h)。所得结果表示至整数。试验结果以平行测定结果的算术平均值为准。在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不大于算术平均值的3%。 分钟生成1偶姻),即为1个酶活力单位,以U/g(或U/示。围本方法规定了方法适用于用分光光度计测定方法不适用于啤酒和其他含醇产品中样中3偶姻)和/或双乙酰的存在会使试验结果偏大。乙偶姻在贮存时易形成二聚体,从而影响试验结果。但若遵循配制步骤中所述的措施去预防,本方法仍可使用。理偶姻在碱性条件下与萘酚和肌酸的混合物反应生成红色产物。通过在522以从乙偶姻标准曲线上得出反应生成的乙偶姻的量,进而计算出)缓冲液:分别称取2-01612 吗啉代乙基磺酸(2-后加入15%拌均匀;用约1后移入5000水定容,搅拌均匀。该溶液在常温(1520)下的保存期为一周。):吸取乙基拌20约1后,再用缓冲液定容。该溶液使用前配制。酚()/肌酸()显色剂:约1的氢氧化钠溶液溶解并定容。该溶液使用前配制。配制时需避光,并且冰浴。警告1毒。对眼和黏膜有刺激性。吞咽或经皮肤吸收都能引起中毒。偶姻(3备液():取一定量的乙偶姻于试管中,在37恒温箱中溶解。然后将试管置于冰水中使乙偶姻重结晶。重结晶后,乙偶姻不含有影响试验结果的乙偶姻二聚体,可用于储备液的配制;入100水溶解并定容。注:乙偶姻对热不稳定,且容易吸潮,因此应放置在干燥器中冷藏(26)保存。如发现物质有明显的吸潮现象,建议放弃不用。该溶液在冷藏条件下的保存期为一周。偶姻标准溶液乙偶姻标准溶液,溶液应每天配制。偶姻标准溶液标准点乙偶姻储备液1析天平: 酸度计: 恒温水浴锅:301) 35是适合的市售产品。也可用同等分析效果的产品。光光度计:可在522 计时器。旋振荡器。01613 偶姻标准曲线的制备分别吸取配制好的乙偶姻标准溶液400L(10后,涡旋振荡器充分混合均匀。置于室温,并开始计时。用分光光度计,在522 标准对照品的制备建议使用一个有代表性的、稳定的样品作为标准对照品。在每次分析中,将该标准对照品与样品一同进行检测,以判断试验的重复性。品溶液的制备从样品中称取一定量的试料,溶液稀释。其稀释的倍数要使样品的最终吸光度 标准曲线的绘制以522偶姻的浓度()为制标准曲线,计算出标准曲线的斜率h(或用回归方程计算)。样品的反应将试样溶液和底物先置于30水浴中预热约10后,按下述方法处理每一个试样溶液:a) 样品吸光度值浴中的10涡旋振荡器充分混匀,迅速放回到水浴中,并开始计时。b) 空白吸光度值缓冲液代替试料溶液,依上述步骤进行操作。c) 涡旋振荡器充分混匀。置于室温,重新开始计时。d) 用分光光度计,在522果计算位为U/g,按式(算:mh(中:样品的吸光度;空白的吸光度;样品溶液反应前的总稀释倍数;m试料的质量,单位为克(g);h标准曲线的斜率。果表示样品的测定结果用算术平均值表示。当结果小于1U/g(或U/给出1位有效数字;当结果大于等于1U/g(或U/小于100U/g(或给出2位有效数字;当结果大于等于100U/g(或U/给出3位有效数字。01614 试验结果以平行测定结果的算术平均值为准。在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不大于算术平均值的10%。围本方法规定了方法适用于用全自动生化分析仪测定方法不适用于啤酒和其他含醇产品中样中3偶姻)和/或双乙酰的存在会使试验结果偏大。乙偶姻在贮存时易形成二聚体,从而影响试验结果。但若遵循配制步骤中所述的措施去预防,本方法仍可使用。理偶姻在碱性条件下与萘酚和肌酸的混合物反应生成红色产物。通过在510照标准曲线进一步计算出酶样品的活力。)缓冲液: ): 萘酚()/肌酸()显色剂:自动生化分析仪:要求带有进样系统、搅拌系统、温度控制系统30检测系统。检测系统要求可在510动力学法检测吸光度变化,时间间隔最少18s。如:兰)或同等分析效果的仪器。析天平: 酸度计:准曲线的制备称取一定量的缓冲液溶解并定容至100到标准储备液。准储备液和标准曲线应每日配制。01615 标准对照品的制备标准对照品的制备按如下操作:a) 取一定量的乙偶姻于试管中,在37的恒温箱中溶解。然后将试管置于冰水中使乙偶姻重结晶。b) 缓冲液溶解并定容至200到标准对照品储备液。然后再用相同的缓冲液稀释20倍备用。二次稀释后的乙偶姻溶液的浓度相当于50mU/准对照品储备液在48并且避光的条件下的保存期为一周。品溶液的制备从样品中称取一定量的试样,用缓冲液溶解稀释。 物保温周期温度:30;时间:480s;底物:40L;水:20L。反应周期温度:30;时间:650s;样品稀释液:40L;水:20L。色反应周期温度:30;时间:240s;01616 显色试剂:80L;水:15L。定周期测定模式:动力学法;波长:510曲线类型:非线性;时间:145s;读数:9次;间隔:18s。准曲线的计算用参数中轴单位为标准点的酶活力mU/ 样品活性的计算从标准曲线上读出样品最终稀释液的活性力,单位为mU/位为U/g,按式(算:4F000(中:由标准曲线得出的样品最终稀释液的活性力,单位为mU/溶解样品用的容量瓶的体积,单位为毫升(D稀释倍数;m试样的质量,单位为克(g);1000品的测定结果用算术平均值表示。品的试验结果有效,可计算平均值。否则,应重新进行试验。当结果小于1U/g(或给出1位有效数字;当结果大于等于1U/g(或小于100U/g(或给出2位有效数字;当结果大于等于100U/g(或给出3位有效数字。g(或,表示为g(或试验结果以平行测定结果的算术平均值为准。在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不大于算术平均值的4%。葡糖苷酶可水解麦芽糖分子及直链麦芽糊精中时将游离出来的葡萄糖残基转移到一个葡萄糖分子或麦芽糖、麦芽三糖分子上,形成键,生成异麦芽糖、潘糖、异麦芽三糖等含键的寡糖的酶。葡糖苷酶活力在40、01617 萄糖,即为1个酶活力单位,以U/ 原理转葡糖苷酶作用于底物成的葡萄糖与含有葡萄糖氧化酶、过氧化酶的4 乙酸溶液:将乙酸(释至1000乙酸钠溶液:将乙酸钠(释至1000乙酸将乙酸溶液(0释至100剂A);将乙酸钠溶液(0释至100剂B);将将甲基)氨基甲烷2水稀释至100041100释至50%苯酚溶液:将苯酚(于50溶液冷却至室温,用水稀释至100入葡萄糖氧化酶(555065U/125U,配随用)。物溶液:将7水稀释至10015可稳定两周)。品溶液的制备称取1确至到适当大小的容量瓶中,用经冷却的水稀释至刻度,混匀。注:乙酸5040恒温水浴箱中保温10匀,于40恒温水浴箱中准确保温60试管转移至沸水浴中加热5后用流水快速冷却。冷却后,加入4匀。将此试管放入40恒温水浴箱中,保温20定500白对照:50匀。将试管转移至沸水浴中加热5后用流水快速冷却。冷却后,加入底物溶液1匀。入4匀。将此试管放入40恒温水浴箱中,保温20定500确称取105下干燥66000g,溶于100别取1水定容至100100g,300g,01618 50050匀。将这些试管放入40恒温水浴箱中,保温20定500准液的空白对照:用水来替代葡萄糖标准液,按上述方法测定空白对照液吸光度 结果计算转葡糖苷酶活力位为U/g,按式(算:G(中,算:G=100000(中:G葡萄糖标准曲线求得的葡萄糖量,单位为微克(g);反应体系的总容量,单位为毫升(反应体系的取样量,单位为毫升(n酶样品的稀释倍数;反应体系中酶样品的添加量,单位为毫升(各反应液对应的吸光度值;空白对照液液的吸光度值。平行试验相对误差不得超过5%。理酶作用于淀粉溶液生成还原糖。然后加入费林试剂,在加热的情况下,定量生成氧化亚铜沉淀。在加入碘化钾和硫酸后,生成游离碘,此时,立即用硫代硫酸钠溶液滴定。0%碘化钾溶液:碘化钾150存在褐色试剂瓶中,避免阳光直射。5%硫酸溶液:硫酸125 硫代硫酸钠溶液:硫代硫酸钠溶液500得溶液的总体积为1000制好后,应进行标定,求出浓度校正系数 1乙酸将1乙酸钠溶液加入到1乙酸溶液中, 可溶性淀粉溶液(将可溶性淀粉(试剂级)在105干燥4后,干)的可溶性淀粉,缓慢加入到沸水50沸5自来水冷却后,加入1乙酸水定容到10