细胞与分子免疫学研究生免疫球蛋白

免疫球蛋白免疫球蛋白编码基因基因工程抗体,南京医科大学微生物学与免疫学系卢 春, 概述,1、免疫球蛋白(immunoglobulin, Ig)：1968和1972年WHO和国际免疫学会决定，将具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白称为免疫球蛋白。 2、抗体(antibody, Ab)： B淋巴细胞在有效的抗原刺激下分化为浆细胞，产生具有与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白，这类免疫球蛋白称为抗体。3、 Ig与Ab的区别和联系： Ig是化学结构上的概念； Ab是生物学功能上的概念；所有的Ab都属于 Ig；并非所有的Ig 都具有Ab 的活性。, 免疫球蛋白的基本结构,1、Ig的组成：由4条肽链通过链间S-S双硫键连接而成，其中两条分子量较大的链称重链（Heavy chain，H链），两条分子量较小链的称轻链（Light chain，L链）。 2、H链：据氨基酸（aa）组成及序列的差异（抗原性）将H链分为5类， 、 、 、 、 链；其分别对应于，IgA、IgD、IgE、IgG、IgM五类Ig。,第一节 免疫球蛋白的结构和功能,Immunoglobulin Structure,3、L链：据aa组成及序列的差异将L链分为2型，、型， ：为2：1（人）。天然Ig单体中，两条重链是同类的，两条轻链是同型的。4、Ig的分区：（1）可变区：在Ig近N端L链的1/2和H链的1/4（ 、 ）或1/5（ 、 ）范围内，因aa组成及序列变化较大，故称可变区（Variable region，V区）。 （2）恒定区：在Ig近C端L链的1/2和H链的3/4（ 、 ）或4/5（ 、 ）范围内，因aa组成及序列变化相对稳定故称恒定区（Constant region，C区）。,Immunoglobulin Structure,5、Ig的结构域又称功能区(Domain)：（1）VH、VL：超变区（HVR1、2 、 3）、互补性决定区（CDR1、CDR2、CDR3），又称Ig独特型决定簇（Idiotype）;,（2）CH1、CL：是各类、亚类、型、亚型Ig遗传标记 所在部位;（3）IgG的CH2：补体C1q的结合位点； IgG 借助 CH2通过胎盘，发挥被动免疫作用；（4）CH3： IgG的CH3与中性粒、巨噬细胞表面表达的 FcR结合，完成免疫调理作用；与NK细胞 表面表达的FcRIII结合，完成ADCC作用；（5） IgE的CH4： IgE的CH4与肥大和嗜碱性粒细胞表 面表达的FcR结合，完成I型超敏反 应；（6）绞链区（Hinge region）：T Y,Immunoglobulin Structure,Fab（Fragment of antigen-binding）Ag bindingValence = 1Specificity determined by VH and VL,Fc（Crystalizable fragment）Effector functions,6、Ig的水解片段 (木瓜蛋白酶),F(ab)2Ag bindingValence =2pFcNo effector functions,6、Ig的水解片段 (胃蛋白酶),7、Ig的其他成分,（1）J链 ：（joining chain）由浆细胞合成，功能是将 单体Ig分子连接为多聚体。如2个IgA单体形 成二聚体；5个IgM单体是形成五聚体。,7、Ig的其他成分,（2）分泌片 ：（secretory piece, SP）由黏膜上皮细胞 合成和分泌，功能是保护分泌型IgA或 的 IgM铰链区免受蛋白酶的降解。, 五类Ig的特点, Ig的生物学活性,1、特异性结合抗原2、激活补体3、与细胞Fc受体结合发挥生物效应（1）免疫调理作用（2）ADCC（3）介导I型超敏反应（4）人IgG的Fc段与SPA结合4、选择性传递,Ab的生物学活性,第二节 免疫球蛋白编码基因和抗体的多样性, 概述,人类B淋巴细胞存在三个编码Ig的基因库，即重链H基因库及轻链、 基因库，它们分别位于第14、2及22号染色体上。,一、胚系B细胞中Ig轻链基因的结构,由3个基因所编码：V基因、J基因编码可变区；C基因编码恒定区，即V-J-C。,（一） 链基因结构,1、 V：V基因节段有90个，呈簇状串联排列（V1Vn，n=90），其中含30个假基因（指无功能性表达或只表达无功能产物的缺陷基因，但它可通过突变、置换及重排形成新的功能性基因，为可变区的多样性提供后备基因）。V编码V区110aa中的196aa；,2、L序列：每个V前都有一个L序列（Leader），编码产物为前导肽，对轻链蛋白合成至关重要；3、J：位于V下游，也呈串联排列，含5个基因节段，编码V区110aa中的97110aa；4、C ：只含单个外显子，编码C区蛋白。,（二） 链基因结构,1、V：V基因节段有60个，呈簇状串联排列（V 1Vn，n=60），其中含30个假基因 ；2、L序列：每个V前都有一个L序列（Leader），编码产物为前导肽，对轻链蛋白合成至关重要；,3、J1C1，J2C2J7C7：C1C7代表各个亚型链的基因节段，其中含4个功能基因节段和3个假基因。,二、胚系B细胞中Ig重链基因的结构,由四个基因所编码：V基因、D基因、J基因编码可变区；C基因编码恒定区，即V-D-J-C。,（一）重链V区基因,1、VH：VH基因节段有95个，成簇状串联排列（VH1VHn，n=95），其中含45个假基因。每个VH前都有一个L序列（Leader），其作用是在合成重链时将重链固定在粗面内质网膜上。LnVHn编码疏水前导肽和CDR1及CDR2；,2、DH，JH：DH有23个节段，成簇状串联排列；JH有9个节段，其中6个功能基因和3个伪基因。DHJH编码CDR3，JH编码可变区的骨架部分（Framework region）。,（二）重链C区基因,1、CH：CH基因节段在染色体上的排列顺序与其编码的Ig在体内成熟的顺序相似，分别是CC C3C1C1C2C4CC2。除C 以外，其他CH基因节段都有一个转换区（Switch region，S区），其作用是控制Ig类型转换；,2、控制膜结合或分泌型Ig的基因：每个CH基因节段后分别排列着S和M两基因，S即分泌型，M即膜结合型，如CSM、C S M 。,三、B细胞分化过程中的基因重排,1、基因重排定义：在B细胞分化和发育过程中，一部分基因节段互相接近、重新排列，形成功能性的免疫球蛋白基因单位，此过程称基因重排（Gene Rearrangement）。功能性的免疫球蛋白基因单位进行转录，经转录后的加工，再表达为免疫球蛋白。,2、可变区的基因重排：（1）重链可变区的基因重排：选择一个DH与一个JH节段连接（DHJH），再选择一个VH与DHJH相连，一旦VHDHJH重排成功且得到功能性表达，其产物就会抑制另一条染色体上等位基因重排，此现象称为等位基因排除。其产物同时启动轻链可变区的基因重排；,（2）轻链可变区的基因重排：链基因优于链基因重排。选择一个V与一个J节段连接VJ，其产物就会发生等位基因排除，同时也会抑制链基因重排，称为同型排除。当两条染色体上的链基因重排都失败时，才会启动链基因重排。两条染色体上的VH基因都是无产物重排，或基因和基因都是无产物重排，细胞凋亡（Apoptosis）。,（3） 可变区的基因重排1223规律和重组酶的作用：可变区的基因重排受基因节段侧面的重组信号序列（RSS）控制，遵循1223规律且与DNA损伤修复系统有关。,（4）重链类型转换：每个CH（C除外）前都含一个S区（短的串联重复序列），S区与重链类型转换有关。在B细胞分化过程中，V-D-J的重排及其与C的连接是不依赖抗原刺激，重排的V-D-J与C和C连接，经转录加工，此时在B细胞表面表达mIgM和/或mIgD。成熟的B细胞在抗原刺激下， B细胞在分泌IgM和/或IgD的同时，V-D-J从与C基因连接转换到与C或C或C的连接，完成了类型转换。,2、Ig的多样性：（1） 组合性连接：重链的V-D-J连接（95个V基因、23个D基因，9个J基因）；轻链的V-J-C（90个V基因、5个J基因、一个C基因；60个V基因、7个J基因和C基因）；（2） 接合多样性：发生在D-J、V-D-J、V-J连接时，1密码子错位；2框架（ORF）移位；3N-序列插入；（3） 体细胞突变：体细胞突变也可以产生Ig的多样性。,3、重排过程,第三节 基因工程抗体（Genetic Engineering Antibody）,概述,单克隆抗体(McAb)在临床疾病诊断和治疗中已发挥了很大的作用，但以下几点限制了抗体的导向治疗：（1）鼠源性McAb在人体内易诱导免疫应答；（2）人的McAb制备甚为困难。,一、嵌合抗体（Chimeric Antibody）,原理：保留鼠Ig可变区部分，将其恒定区用人Ig取代。方法：PCR克隆鼠可变区基因和人恒定区基因，将两 基因连接，并插入原核或真核表达载体中，并 导入大肠杆菌或转染真核细胞，就可表达出嵌 合抗体分子。优点：亲和力保持良好。缺点：含鼠Ig可变区的异源性，仍易诱导人免疫应答。,原理：仅保留鼠Ig可变区CDR部分，将Ig其它区域都 用人Ig取代。方法：CDR序列的获得通常采用PCR技术。 优点：大大降低了鼠抗体的免疫原性。缺点：亲和力不佳。,二、CDR移植抗体（CDR Grafting Antibody）,又称重构抗体或改形抗体（Reshaped Antibody）,原理：将鼠Ig Fv中的VH和VL两肽链用不同的连接物 连接成一条多肽链，称为单链抗体（ScFv）； 将两个相同或不同特异性的ScFv连接在一个分 子上，就获得了双价ScFv。 方法：DNA重组技术；共价或非共价交连。 优点：亲和力保持良好，可针对2个不同的抗原表位。缺点：容易解离或被组织酶解。,三、单链抗体（ScFv）和双价ScFv,原理：将鼠Ig Fab基因片段与丝状噬