《考马斯亮蓝法测定》PPT课件

考马斯亮蓝法测定紫菜可溶性蛋白含量,提纲,前言材料与方法结果与分析研究目的及意义,前言,1紫菜的生物学特征紫菜（Porphyra）属于红藻门（Rhodophyta）红藻纲（Rhodophyceae）红毛菜亚纲（Bangiophycidae）红毛菜目（Bangiales）红毛菜科（Bangiaceae）。目前报道的种类约有130多种，广泛分布在世界各地。东亚地区属紫菜盛产区域，条斑紫菜（Porphyrayezoensis）是中、日、韩三国共同栽培品种，在我国长江以北广泛栽培，而在长江以南栽培的坛紫菜（P.haitanensis）属我国特有。条斑紫菜为北太平洋西部特有的种类，自然界主要分布于我国东海北部和黄、渤海沿岸，以及日本列岛和朝鲜半岛沿岸。条斑紫菜藻体为叶片状，叶形多为卵形或长卵形，随生长环境有较大的变化。坛紫菜主要产于我国福建和浙江沿海，盛产于福建的平潭、莆田、惠安等县，为我国特有的暖温带性种类，藻体披针形、亚卵形或长卵形。,紫菜的营养价值,紫菜（Porphyra）作为一种经济价值巨大的栽培红藻，以其营养丰富、口感良好深受特别是东亚地区人民的喜爱。紫菜中含有丰富的蛋白质、氨基酸、多糖、膳食纤维、胡萝卜素、维生素A、维生素B1、B2，维生素C、维生素B12和胆碱等多种有机物质，同时还含有人体所需的Ca、P、Fe、Mg、I、Se、Zn和Mn等多种矿物质。刘兴宽，郁建平(2008)在对沿海滩涂甘紫菜营养成分分析中，检测出15种游离氨基酸和16种水解氨基酸，必需氨基酸占游离氨基酸总量的2435，占水解氨基酸总量的39.81；维生素和微量元素种类多、含量高，样品中Vc含量为17.2mg100g；微量元素中Na的含量最高为356.7mg100g，其次是Ca、Mg和K，Pb和Cu的含量远低于指标值。,仲明等（2003）在对条斑紫菜不同采收期主要营养成分变化情况中指出条斑紫菜的钙、镁、锌和碘含量较丰富，尤其是钙和碘含量较多，铅、镉含量均低于食品卫生标准。所含的维生素种类多、含量高，明显高于动物性食品，胡萝卜素、维生素E含量尤为突出。蛋白质的含量是衡量紫菜品质优劣的一项重要指标。紫菜中的蛋白质含量随着藻的种类及生长时间、地点等而有所不同，通常蛋白质质量分数占紫菜干质量的25%50%。,牛建峰等（2006）利用Bradford法，测得60恒温干燥的带形蜈蚣藻可溶性总蛋白质量分数为0.33，带形蜈蚣藻是红藻门蜈蚣藻属植物，其可溶性蛋白含量很少。刘淑梅等（2009）对9份辣椒种子的可溶性蛋白含量进行了测定，结果表明辣椒种子蛋白含量为25.6529.22，远高于其他蔬菜类作物的蛋白质含量，辣椒种子蛋白质含量是辣椒皮的20倍，辣椒种子蛋白质仅低于大豆的蛋白含量(36.2349.26)。这表明辣椒种子具有较高的蛋白质开发价值。粱月等（2010）通过对布泽乌区采集的不同品种浆果分析得出可溶性蛋白含量从22.3945.35，含量很高。,蛋白质的测定方法,在许多蛋白质研究的领域中，用一种快速准确的方法来检测蛋白浓度是必不可少的。目前测定蛋白质含量的方法有多种，如凯氏定氮法、双缩脲法、紫外吸收法、等电点沉淀法、考马斯亮蓝染色法等几种方法，但就方法的准确性和精密度以及应用程度而言，国际经典测定方法凯氏定氮法为首选。现在尽管有很多先进的自动或半自动凯氏定氮仪，但这些仪器不仅价格昂贵，且需专门试剂，目前尚难普及21。一种新建立的考马斯亮蓝法在许多实验中已成为首选方法用来定量的检测蛋白浓度。,凯氏定氮法测定蛋白质最常用的方法是凯氏定氮法。凯氏定氮法测定蛋白质分为样品消化、蒸馏、吸收和滴定过程。在催化剂作用下,试样用浓硫酸消煮破坏有机物,使其中的蛋白质氮及其他有机氮转化为氨态氮,然后与硫酸结合生成硫酸铵,加入强碱进行蒸馏使氨逸出,用硼酸吸收后,再用酸滴定,测出含氮量,将结果乘以换算系数,计算出粗蛋白质含量。然而该方法存在消化时间太长,会产生有毒有害该方法存在消化时间太长，会产生有毒有害气体，因此必须在通风橱中进行的弊端。宗留香等人对这一传统方法进行了改进，即用Se粉作催化剂进行消化，不用通风橱，即实现了环保消化，并提高了消化效率。,考马斯亮蓝法考马斯亮蓝G一250测定蛋白质含量原理是属于染料结合法的一种，存在红色与蓝色两种不同的颜色形式。该染料在游离状态下呈红色，在稀酸溶液中与蛋白质的疏水区结合时变为蓝色。考马斯亮蓝G250与蛋白质结合反应十分迅速而且稳定，反应2min左右即达到平衡，其结合物可在室温下1h内保持稳定。考马斯亮蓝G-250法是目前灵敏度最高的蛋白质测定方法，其最低蛋白质检测量可达1g，比Lowry法的灵敏度高约4倍，这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大得多。该法方法简便，易于操作，所用试剂较少，显色剂易于配制；干扰物质少，如糖、缓冲液还原剂和络合剂等均不影响显色。,结果与分析,2.1测定波长的选择及标准曲线的绘制取160ug/mL标准蛋白质溶液用LAMBDA25紫外/可见光光度计450750nm进行波长扫描,由扫描曲线可见标准蛋白质溶液的最大吸收波长为595nm,，故本法选择的测定波长为595nm。图1最大吸收峰的测定Fig.1Analysiaoftheproperabsorbing,2.2显色稳定性考察,取1ml200ug/ml标准蛋白质加入5ml考马斯亮蓝G-250溶液，摇匀，放置3min后倒入比色皿，在595nm处，每隔30s测定其吸收度，测定结果如下图所示：图2稳定性考察Fig.2Investigationonthestability,陆建良等(2002)的研究表明，蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合后，在25min即呈最大光吸收，至少稳定1h。我们在试验中发现考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合，即使在5min到20min后，在595nm处的光吸收值也不是很稳定，总是在一定幅度内摆动，如果仪器的灵敏度高，这种摆动误差就更大。为了减少试验误差，应将仪器的狭缝调大些，以降低灵敏度，增加稳定性。,2.3蛋白标准曲线的绘制,图3蛋白质标准曲线Fig3Thestandardcurveoftheproteins一月二月,三月四月,1，2，3，4月采集样品蛋白测定的回归方程分别为：y=0.0049x+0.1398，r=0.0093；y=0.005x+0.1262，r=0.9994；y=0.0049x+0.1464，r=0.9993；y=0.0048x+0.2774，r=0.9992。各次测定的蛋白回归方程式相关系数r在0.99920.9994之间，蛋白含量与595nm处吸光值线性关系良好。,2.4不同紫菜可溶性蛋白含量随生长时期不同而变化,图4不同紫菜中蛋白含量Fig.4.ThedissolvableproteincontentsofdifferentPorphyra,一月Y-gr组测得的蛋白含量最高，为282.37+12.54；对照组测得的蛋白含量为241.73+4.29，居第二；其次是Y-L0601含量为220.92+4.58；Y-06DO含量为206.21+4.01；Y-L0602含量为205.00+4.62；最低的是坛紫菜含量为190.60+3.23。二月所有组的蛋白含量同一三四月比都是最高的，蛋白质的含量是衡量紫菜品质优劣的一项重要指标，所以一二三四月中二月可能是采收的最好季节。,三月蛋白含量和二月相比普遍下降，下降最明显的是Y-gr，从二月的290.77+5.90mg/g下降到三月的208.96+5.18mg/g；其次为Y-L0602从二月的227.36+4.87mg/g下降到三月的175.30+3.14mg/g；最低的是对照组从二月的247.13+3.76下降到三月的231.69+2.12mg/g。四月采集的各样品中蛋白含量是各生长时期最低的，各紫菜样品中含量存在较大差异。对照组蛋白含量最高，坛紫菜最低。蛋白含量从高到低顺序为：对照Y-grY-06DOY-L0601Y-L0602坛紫菜。,图5紫菜中蛋白含量随生长时间的变化Fig.5ThedissolvableproteincontentsofdifferentstageofPorphyra,一月二月，Y-gr样品的蛋白含量高于其他5个组，三月四月仅次于对照组。坛紫菜的蛋白含量始终最低。蛋白含量随生长时间的变化呈明显的规律，1，2月采集样品中蛋白含量较高，随后其蛋白含量均出现一定程度的下降。Y-gr下降程度最高，下降了28.13%，其次为Y-L0602下降了22.90%，接着是Y-06DO下降了19.60%，Y-L0601下降了19.07%，坛紫菜下降了11.38%，最低的是对照组下降了6.32%。,以上结果均说明，紫菜中可溶性蛋白含量不仅与藻的种类及其品系密切相关，而且同一紫菜蛋白含量随生长时期的变化有所差异。姚兴存等（2002）对连云港沿海条斑紫菜一般营养成分进行了测定及研究与分析了随季节变化的规律，结果表明几种营养成分中，含量变动最为明显的是蛋白质和碳水化合物，二者之间呈显著的负相关关系。在紫菜生长的前期蛋白质含量高，之后随生长时间的延长，逐渐减少，而碳水化合物则恰恰相反。分析原因是由于处在生长初期的紫菜细胞不断地进行分裂，以蛋白质为中心的代谢十分旺盛。相反到了生长末期，细胞分裂能力下降，碳水化合物的代谢变得旺盛，使得细胞壁和细胞间隙物质增厚增多起来。由此，生长初期的紫菜加工出来的紫菜制品，营养价值较高，色、香、味也达到较高水平，生长末期的加工产品则品质出现一定程度的下降。,目前测定蛋白质含量的方法有多种,如凯氏定氮法、双缩脲法、紫外吸收法、等电点沉淀法、考马斯亮蓝染色法等几种方法,但就方法的准确性和精密度以及应用程度而言,国际经典测定方法凯氏定氮法为首选。现在尽管有很多先进的自动或半自动凯氏定氮仪,但这些仪器不仅价格昂贵,且需专门试剂,目前尚难普及。考马斯亮蓝法在许多实验中已成为首选方法用来定量的检测蛋白浓度。牛建峰等（2006），建立了Bradford法测定带形蜈蚣藻可溶性总蛋白含量的测定方法，并认为此法操作简单，成本低廉，耗时短。,王卫国等（2002）用双缩脲法、紫外吸收法、考马斯亮蓝染色法三种方法对灰树花多糖中蛋白质含量进行测定，并同微量凯氏定氮法进行对比。结果表明马斯亮蓝G-250染色法在包括灰树花多糖在内的多种真菌类多糖中蛋白质含量检测时其结果较为准确，而且其操作简单，测定迅速，对设备要求较低，是测定灰树花多糖中蛋