基因扩增技术ppt课件

PolymeraseChainReaction聚合酶链反应（PCR）,Polymerasechainreaction又称无细胞分子克隆系统或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增法，在模板DNA，引物（模板两端的已知序列）和四种脱氧核苷酸存在的情况下，DNA聚合酶依赖的酶促合成反应。,PCR的定义,PCR技术是由Cetus公司和加利福利亚大学1985年联合创造的，主要贡献者为KaryBmulis和HeneryA、Erlich。可将极微量的靶DNA特异地扩增上百万倍，能检测每10万个细胞中仅含一个靶DNA分子的样品。因而发明人KaryB、mulis获1993年诺贝尔化学奖。,1993年获诺贝尔化学奖,PCR的种类,重复实验：为防止因各种原因引起的实验误差，应进行反复验证，以确保实验结果的重演性。,污染的处理,酸处理：用1M的稀盐酸擦拭或浸泡污染器件，可促进DNA脱嘌呤；紫外灯照射：UV波长一般选择254/300nm，照射30分钟即可。紫外照射可促使DNA形成二聚体，阻止链的延伸。紫外照射对长片段的DNA有效，对短片段效果不大。,巢式PCR(nestedPCR),对于极微量的靶序列，一次扩增很难取得满意的效果，则可用巢式PCR进行多次扩增。引物之间的关系如下图所示：引物1和引物4进行第一次扩增，其产物作为模板，用引物2和3作为再次PCR的引物。如果一次PCR产物在凝胶上有可见的条带，二次PCR只能用第一次PCR产物的1/104-105为模板。,实时定量荧光PCR,实时PCR（realtimePCR）是1996年以来发展起来的一种新技术。1、荧光定量PCR技术的整个操作过程在完全封闭的状态下进行，有效的避免了“假阳性”的实验结果。2、荧光探针的使用提高了检测灵敏度和特异性，并能够准确定量样品的模板数。3、PCR扩增后不需进行电泳等后处理，而直接定量样品模板数，使其具有分析时间短，重复性好、省力、低费用等优点。,TaqMan探针,ATaqMan探针同时带有荧光报道子和淬灭子，无荧光信号发生；B在退火阶段，引物和探针同时与模板结合；C在延伸阶段，Tag酶将探针水解，报道子被切割，使得荧光信号释放，荧光信号的强弱与模板的量成正比。,荧光染料掺入法,某些染料能够特异性地结合到双链DNA上，而不结合到单链DNA上，而且与双链DNA结合后的染料发光强度会明显增加，检测结合到双链DNA上的荧光染料发出的荧光可实时监测PCR扩增产物的数量。SYBRGreenI是一种结合于DNA双螺旋小沟中的荧光染料。其最大吸收波长约为497nm，最大发射波长约为520nm。优点：1、由于它与所有的双链DNA相结合，不因模板不同而特别定制通用性好，且价格相对较低。2、由于一个PCR产物可以与多分子的染料结合，因此其灵敏度很高。缺点：1、由于SYBRGreenI与所有的双链DNA相结合，引物二聚体、单链二级结构以及非特异扩增产物可引起假阳性。因此，只限于分析特异性扩增产物；（可用溶解曲线分析产物的特异性）染料可影响扩增效率。,实时定量PCR的Ct值概念,Ct值是实时定量PCR技术中进行定量的一个重要参数。阈值是显著大于背景信号的荧光信号值。它总是出现在扩增的指数期。达到荧光阈值所需的最小循环数为Ct值。在反应的起始，模板数越多，达到荧光信号阈值所需的循环数越少。,实时定量PCR检测前列腺基质细胞中GAPDH和TGFb1表达的荧光曲线图(SYBRGreenI掺入法),40,实时定量PCR检测前列腺基质细胞中GAPDH和TGFb1表达的熔解曲线图（单一峰表明产物是单一的，无非特异扩增）,41,实时定量PCR检测前列腺基质细胞中TGFb1的表达,Ct=目的基因的Ct值-内参照基因的Ct值Ct=实验组样品的Ct-对照组样品的Ct,42,实时定量PCR检测前列腺基质细胞中TGFb1表达的柱形图,TaqMan探针检测PSA质粒（107拷贝至103拷贝）的荧光曲线图,44,TaqMan探针检测PSA质粒的Ct值得出的标准曲线y=-0,23x+11,06;r2=0,993（y是模板的对数，x是Ct）,45,实时PCR定量检测将LNCap细胞梯度掺入到4ml