过氧化物酶、过氧化氢酶活性测定方法及试剂配制

过氧化物酶（POD）活性测定【实验原理】过氧化物酶广泛分布于植物的各个组织器官中，在有H202存在条件下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色的4-邻甲氧基苯酚，可用分光光度计测生成物的含量来测定活性。【实验试剂】 愈创木酚、30%过氧化氢、20mmol/LKH2PO4、100mmol/L磷酸缓冲液（pH6.0）、反应混合液100mmol/L磷酸缓冲液（Ph6.0）50mL，加入愈创木酚28uL,加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液溶解冷却后，加入30%过氧化氢19uL，混合均匀保存在冰箱中【方法步骤】（1）、粗酶液的提取 称取小麦叶片0.25g，加20mmol/LKH2PO4 2.5mL，于研钵中研成匀浆，以4000r/min离心10分钟，收集上清液保存在冷处，所得残渣再用20mmol/LKH2PO4 2.5mL提取一次，全并两次上清液，所得的即为粗酶提取液(酶活性过高，稀释10倍)。（2）、酶活性的测定 取试管3只，于一只中加入反应混合液3mL，KH2PO41mL，作为校零对照，另外三只中加入反应混合液3mL，稀释后的酶液1mL（如表1），立即开启秒表，于分光光度计470nm波长下测量OD值，每隔1min读数一次（4min）。以每分钟表示酶活性大小，将每分钟OD值增加0.01定义为一个活力单位。表1 紫外吸收法测定POD酶活性配置表管 号S0（对照）S1（实验）S2（实验）反应混合液(ml)3.03.03.0KH2PO4 (ml)1.00.00.0酶液 (ml)0.01.01.0 4.结果计算 以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以 A 470 /min g （鲜重） 表示之。也可以用每 min 内 A 470 变化 0.01 为 1 个过氧化物酶活性单位（ u ）表示。 POD总活性u/g(FW)= FW tV.VAT1470010D 式中：POD总活性以酶单位每克鲜重表示。其中 470=ACK-AE比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示。 ACK 照光对照管的吸光度。 AE 样品管的吸光度。 Vt 样品液总体积，mL。 V1 测定时样品用量，mL。 W样品鲜重，g。 蛋白质含量单位为mg/g。过氧化氢酶的活性测定紫外吸收法【原理】H2O2在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度(A240)随反应时间而降低。根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。【试剂】0.2mol/L pH7.8磷酸缓冲液：取A液91.5ml，B液8.5ml,充分混合。0.1mol/L H2O2 以30%的过氧化氢稀释(30*1.1g/34.01)mol/100ml=9.7mol/L,取0.52ml 30%的过氧化氢稀释到50ml. 【方法】 1.酶液提取：称取新鲜小麦叶片或其它植物组织0.5g置研钵中，加入2ml 4下预冷的pH7.8磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，再用缓冲液冲洗研钵数次定容至25ml，合并冲洗液，混合均匀后置于5冰箱中静置10min，取上部澄清液在4000rpm下离心15min，上清液即为过氧化氢酶粗提液，5下保存备用。2.测定：取10ml试管3支，其中2支为样品测定管，1支为空白管，按表2顺序加入试剂。表2 紫外吸收法测定H2O2样品液配置表管 号S0（对照）S1（实验）S2（实验）粗酶液(ml)0.2（煮死）0.20.2pH7.8磷酸(ml)1.51.51.5蒸馏水(ml)1.01.01.0 煮死酶在沸水浴中煮沸5min. 30预热后,逐管加入0.3ml 0.1mol/L的H2O2，每加完一管立即记时，并迅速倒入石英比色杯中，240nm下测定吸光度，每隔1min读数1次，共测4min，待3支管全部测定完后，按下式计算酶活性。 3.结果计算： 以1min内A240减少0.1的酶量为1个酶活单位（u）。 过氧化氢酶活性(u/gFW/min)=式中：POD总活性以酶单位每克鲜重表示。其中 470=ACK-AE比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示。 ACK 照光对照管的吸光度。 AE 样品管的吸光度。 Vt 样品液总体积，mL。 V1 测定时样品用量，mL。 W样品鲜重，g。 蛋白质含量单位为mg/g。 所需试剂的配制A液：0.2 mol/L Na2HPO4-12 H2O 71.64g定容至1000mlB液：0.2 mol/L NaH2PO4-2H2O 31.2g定容至1000ml1、超氧化物歧化酶SOD活性测定0.05mol/L磷酸缓冲液(pH7.8)取A液228.75ml，B液21.25ml定容至1000mL。130mmol/L甲硫氨酸(Met)溶液：称取1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100mL 750u mol/L氮蓝四唑溶液：称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100mL，用前配避光100u mol/L EDTA-Na2溶液：称取0.03721g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000mL。用前配置，避光保存。20u mol/L核黄素溶液：称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml，用前配置，避光2、过氧化物酶POD活性测定愈创木酚、30%过氧化氢、100m mol/L磷酸缓冲液（pH6.0）：分别取贮备液A：0.2 mol/L Na2HPO4 6.15mL溶液与贮备液B ：0.2 mol/L NaH2PO4溶液43.85mL充分混匀定容至100mL。20m mol/L KH2PO4：称取0.681g KH2PO4定容至250mL.3、过氧化氢酶CAT活性测定0.2mol/L pH7.8磷酸缓冲液,取A液91.5ml，B液8.5ml,充分混合。0.1mol/L H2O2以30%的过氧化氢配制： 30%的过氧化氢密度为1