第六章 亲和分离技术.pptx

第六章亲和分离技术,生物大分子之间的特异性结合作用称为生物亲和作用（bioaffinity），简称亲和作用，如抗原与抗体、酶与酶原（或抑制剂、底物）、核酸与互补碱基链等。利用亲和作用纯化生物大分子的生化分离技术称为亲和分离技术，它是基于固定相的配基与生物分子间的特殊生物亲和能力的不同来进行相互分离的。,1,2020/5/22,第一节亲和技术发展,1910年有人发现不溶性淀粉可以选择性吸附生物组织抽提液中的-淀粉酶，这是亲和分离法的最初应用及报道。1951年Campbell等利用半抗原（对氨苯甲基）修饰纤维素制备的载体为亲和吸附介质从血清中纯化了抗体，这是人们开始有意识利用生物亲和作用纯化蛋白质的研究。由于亲和吸附介质制备技术的障碍，亲和分离技术的实用化进程进展缓慢。,2,2020/5/22,1967年Axen和Cuatrecasas等开发了利用溴化腈活化琼脂糖凝胶制备亲和吸附介质的方法，才使亲和分离技术从研究走向实用。20世纪80年代以后，亲和技术与其他分离技术如膜分离、萃取技术、电泳技术、色谱技术等相结合，相继出现了亲和色谱、膜亲和过滤、亲和萃取、亲和电泳等新型的亲和分离技术。其中最典型的是亲和色谱技术。,3,2020/5/22,第二节亲和分离原理,一、生物亲和作用affinity（亲和）一词源于拉丁语的affinitus，原意为结婚或亲缘关系，因此在化学或生物化学中，affinity可以理解为分子之间的结合作用。实际上，亲和作用不止限于生物物质之间，对于简单的化合物，如Na+和Cl-通过静电作用相互吸引的现象也是一种亲和作用。因此，亲和作用是自然界普遍存在的现象，只是生物分子间的亲和作用具有更高的选择性。,4,2020/5/22,生物物质，特别是酶和抗体等蛋白质，具有识别特定物质并与该物质的分子相结合的能力。这种识别并结合的能力具有排他性，即生物分子能够区分结构和性质非常接近的其他分子，选择性地与其中某一种分子相结合。生物亲和作用是生命诞生、维持与延续的重要基础，而亲和分离技术则是人类利用生物亲合作用的方式。,5,2020/5/22,亲和作用的本质：锁钥理论参与亲和作用的两个分子（或物质）中，其中之一为蛋白质的情况占绝大多数，或者两者均为蛋白质。蛋白质是高分子化合物，种类繁多、结构复杂，其参与亲和作用的机理尚不完全清楚，一般认为是蛋白质的立体结构中含有某些参与亲和结合的部位，这些结合部位呈凹陷或凸起状，能与该蛋白质发生亲和作用的分子恰好可以进入到此凹陷结构中，或者该蛋白质的凸起部位恰好能够进入与其发生亲和作用的分子的凹陷部位，就像钥匙和锁孔的关系一样。,6,2020/5/22,7,2020/5/22,具有亲和作用的分子对之间具有钥匙和锁孔的关系是产生亲和作用的必要条件，但并不充分，除此之外，要想发生亲和作用还需要分子或原子水平的各种相互作用。（1）静电作用（2）氢键（3）疏水性相互作用（4）配位键（5）弱共价键,8,2020/5/22,静电作用：近距离产生较大的作用力，但应与其它因素结合才能具有亲和识别作用。氢键：分子中的氧原子和氮原子，可形成氢键作用。与原子间距离有关，应较近。疏水性相互作用：需两分子都具有疏水性基团。配位键：咪唑基（组氨酸）和Zn2、Cu2、Ni2等产生配位键，形成金属螯合结构。弱共价键：可逆共价键，结合力较弱。,9,2020/5/22,二、影响亲和作用的因素1、离子强度离子强度影响静电引力、氢键作用、疏水相互作用等。离子强度越大，静电力和氢键力都降低，而疏水作用增强。2、pH值在适当的pH下，亲和结合作用较高，在其它pH下，亲和作用减弱或完全破坏。如：当蛋白质的结合部位存在羧基时，在pH值等于该羧基的pKa时，该羧基的50%带负电荷，当pH值高于pKa一个pH单位时，该羧基的90%带负电荷，当pH值低于pKa一个pH单位时，该羧基的10%带负电荷。,10,2020/5/22,3、抑制氢键形成的物质脲和盐酸胍的存在可抑制氢键的形成，但容易使蛋白质变性。4、温度温度升高，静电力、氢键、金属配位键减弱，疏水力增强。5、离液离子SCN-，I-，ClO4-等离子半径较大的离液阴离子（破坏水化作用）存在时，疏水性亲和作用降低。6、螯合剂加入螯合剂（如EDTA），去除金属离子，破坏配位键，会使亲和作用消失。,11,2020/5/22,三、亲和作用体系将亲和体系中的一种分子与固体粒子共价偶联，可特异性结合另一种分子（目标产物），使其从混合物中高选择性地分离纯化。一般将被固定的分子称为其亲和结合对象的配基（ligand），用L表示。Kd：解离常数Keq：结合常数Keq越大，亲和结合作用越强。Keq一般为104108L/mol，最高（生物素抗生物蛋白）可达到1015L/mol。,12,2020/5/22,亲和配基必须具备的条件(选择原则)：（1）专一性识别或特异性作用必须是可逆的配基与被分离生物大分子之间的专一性识别或特异性作用，必须是可逆的。（2）结合常数要适当配基与被分离分子之间结合力要有足够高，以能形成稳定的复合物；同时结合又不能太强，否则洗脱困难。（3）稳定性好，可进行化学改性（4）固定到载体上后配基的专一性识别或特异性作用不发生明显的变化。,13,2020/5/22,专一性和特异性决定着分离纯化的产品纯度，相互作用的强弱决定着吸附和解吸的难易程度。,14,2020/5/22,配基的类型：单专一性的小分子配基基团专一性的小分子亲和配基专一性的大分子亲和配基免疫亲和配基基团专一性的大分子亲和配基,15,2020/5/22,16,2020/5/22,（1）酶的抑制剂小分子抑制剂有苄脒（benzamidine）、精氨酸和赖氨酸等。（2）抗体利用抗原与抗体间特异性结合的亲和技术称为免疫亲和技术。抗体与抗原之间的Keq一般为1071012L/mol。因此，利用免疫亲和法是高度纯化蛋白质类生物大分子的有效手段。,17,2020/5/22,（3）A蛋白ProteinA为分子量约42kD的蛋白质，与IgG具有很强的亲和作用，结合部位为IgG分子的Fc片段。A蛋白分子上含有5个Fc片段可结合部位。不同IgG的Fc片段的结构非常相似，因此A蛋白可作为各种抗体的亲和配基，但不同抗体的结合常数有所不同。A蛋白与抗体结合并不影响抗体与抗原的结合能力，因此A蛋白也可用于分离抗原-抗体的免疫复合体。,18,2020/5/22,（4）凝集素凝集素（lectin）是与糖特异性结合的蛋白质（酶和抗体除外）的总称。伴刀豆球蛋白A（concanavalinA，conA）可用做糖蛋白、多糖、糖脂等含糖生物大分子的分析、纯化。pH5.6时conA为二聚体，分子量为52kD；pH5.6时为四聚体，分子量为102kD，两个亚基（subunit）之间通过二硫键结合。因此，在利用conA为配基的亲和分离技术中，操作条件应当适宜。,19,2020/5/22,（5）辅酶和磷酸腺苷脱氢酶和激酶与辅酶之间具有亲和结合作用。辅酶主要有NAD（nicotinamideadeninedinucleotide）、NADP（NADphosphate）和ATP（adenosinetriphosphate）等。这些辅酶可用做脱氢酶和激酶的亲和配基。AMP（adenosine5-monophosphate）、ADP（adenosine2，5-diphosphate）的腺苷部分与上述辅酶的结构类似，可用做这些酶的亲和配基。,20,2020/5/22,（6）三嗪类色素Triazinedyes是一类分子内含有三嗪环的合成染料，与NAD的结合部位相同，又称为生体模拟色素（biomimeticdye）。除脱氢酶和激酶外，三嗪类色素还与血清白蛋白、干扰素、核酸酶和糖解酶等具有很高的亲和力。CibacronBlueF3GA：,21,2020/5/22,（7）过渡金属离子Cu2+，Ni2+，Zn2+和Co2+等过渡金属离子可通过与亚胺二乙酸（IDA）或三羧甲基乙二胺（TED）形成螯合金属盐固定在固定相粒子表面，用做亲和吸附蛋白质的配基。（8）组氨酸组氨酸可与蛋白质发生亲和结合作用：静电和疏水性相互作用均有可能参与亲和结合。在盐浓度较低和pH约等于目标蛋白质pI的溶液中，固定化组氨酸的亲和吸附作用最强，随着盐浓度增大，亲和吸附作用降低。,22,2020/5/22,（9）肝素肝素（heparin）是存在于哺乳动物的肝、肺、肠等脏器中的酸性多糖类物质，分子量一般为5至30kD，具有抗凝血作用。肝素与脂蛋白、脂肪酶、甾体受体、限制性核酸内切酶、抗凝血酶、凝血蛋白质等具有亲和作用，可用作这些物质的亲和配基。肝素的亲和结合作用在中性pH和低浓度盐溶液中较强，随着盐浓度的增大结合作用降低。,23,2020/5/22,亲和配基的选择（1）组合化学肽库选择亲和配基目标肽反义肽组合合成亲和筛选优选序列（2）噬菌体展示技术目标蛋白可结合噬菌体扩增多轮筛选单克隆群体氨基酸序列（3）SELEX技术随机序列PCR扩增特异性结合重复筛选,24,2020/5/22,间隔臂当配基的分子量较小的时候，如果将其直接固定到载体上，会由于空间位阻的影响，配基与生物大分子不能发生有效的结合。这时需要在配基和载体之间引入一个间臂分子，使配基和生物大分子发生有效作用。,25,2020/5/22,26,2020/5/22,引入间臂分子最常用的方法:先将间臂分子氨烷基化合物NH2(CH2)nCOOH、NH2(CH2)nNH2连接到载体上。然后将亲和配基连接在间臂分子上。羧基和氨基在碳二亚胺的作用下可以缩合形成酰胺键。间臂的长度是很重要的因素，太短，效果不明显；太长，间隔臂容易弯曲，结合效果会下降。实验结果表明，一般引入46个亚甲基时，间臂分子效果较好，常用的间臂分子为-氨基己酸、1，6-二氨基己烷。,27,2020/5/22,载体要求：（1）具有亲水、多孔结构；（2）含有可活化的反应基团；（3）理化性质稳定，不因共价偶联反应的条件及吸附条件的变化而发生变化；（4）非特异吸附小。多糖类的凝胶过滤介质表面含有大量可活化的羟基可作为亲和配基的载体。表面具有氨基的聚丙烯酰胺类的载体也常作为亲和配基的载体。还可采用一些无机载体如硅胶和多孔玻璃。,28,2020/5/22,常用载体,纤维素(cellulose)琼脂糖凝胶葡聚糖凝胶聚丙烯酰胺凝胶多孔玻璃珠（Bio-Glass）其它载体壳聚糖(Chitosan),29,2020/5/22,（1）纤维素纤维素结构紧密、均一性差，不利于大分子的渗入。非特异性吸附力较强，空间位阻。主要用于分离与核酸有关的物质。（2）琼脂糖凝胶琼脂糖浓度有2%、4%、6%，商品为Sepharose2B、4B和6B（Pharmacia）。保持吸附物质活性，能迅速活化并接上各种功能基团，结构疏松孔径大，流速快。稳定性好，能在pH314中应用。,30,2020/5/22,（3）葡聚糖凝胶：葡聚糖凝胶孔径太小，偶联配基后，孔径更小，应用受到限制。（4）聚丙烯酰胺凝胶：Bio-gelP有供化学反应的酰胺基，能制得配基含量较高的亲和柱，适用于亲和势比较低的系统。pH过高或过低的溶液中酰胺基易水解。,31,2020/5/22,（5）多孔玻璃珠：化学与物理稳定性较好，机械强度高。缺点：亲水性不强，对蛋白质尤其是碱性蛋白质有非特异性吸附，化学活性基团少。（6）其它载体壳聚糖,32,2020/5/22,第三节亲和分离技术的应用,一、亲和分离过程1、配基固定化：配基与载体偶联，结合成具有特异亲和性的分离介质。2、吸附样品：亲和层析介质选择性吸附生物活性物质。3、样品解吸：选择适宜的条件使被吸附物活性物质解吸。,33,2020/5/22,目标产物的洗脱方法有特异性洗脱和非特异性洗脱。（1）特异性洗脱剂含有与亲和配基或目标产物具有亲和结合作用的小分子化合物，通过与亲和配基或目标产物的竞争性结合，洗脱目标产物。例如：Lys和Arg均为t-PA（组织纤溶酶原激活剂，一种糖蛋白）的抑制剂，利用固定化Lys为配基亲和分离t-PA时，可用Arg溶液进行洗脱。利用conA为配基的目标产物可用葡萄糖溶液洗脱。,34,2020/5/22,特异性洗脱法的洗脱条件温和，有利于保护目标产物的生物活性，另外，由于仅特异性洗脱目标产物，对于特异性较低的亲和体系（例如，用三嗪类色素为配基时）或非特异性吸附较严重的物系，特异性洗脱法有利于提高目标产物的纯度。（2）非特异性洗脱通过调节洗脱液的pH、离子强度、离子种类或温度等降低目标产物的亲和吸附作用。,35,2020/5/22,二、亲和分离技术1、亲和色谱利用偶联有亲和配基的层析介质为固定相，根据生物分子之间的亲和作用进行物质分离的色谱方法。与固定床吸附操作类似，其过程包括：进料（feedstockloading）杂质清洗（contaminantwashing）目标产物洗脱（targetproductelution）色谱柱再生（columnregeneration）,36,2020/5/22,对大多数亲和层析，一步可以达到很高的纯化倍数。特异性高的亲和层析洗脱只出一个峰，对亲和作用选择性较低的分离，可用梯度和阶梯洗脱分离目标产物,37,2020/5/22,38,2020/5/22,亲和层析的基本特点：（1）纯化过程简单、迅速，且分离效率高（2）特别适用于分离纯化一些含量低、稳定性差的生物大分子（3）纯化倍数大，产物纯度高（4）必须针对某一分离对象制备专一的配基及寻求稳定的层析条件（5）价格相对较昂贵；（6）在洗脱中，交联在层析介质上的配基可能脱落并进入产品中，从而造成不良影响，如抗体、染料等配基。,39,2020/5/22,亲和色谱的配体理想的配体应符合下面的要求：（1）极低的非特异性吸附。（2）高度的亲水性。（3）较好的理化稳定性。（4）大量的化学基团能被有效地活化，而且容易和配体结合。（5）适当的多孔性。一般亲和吸附剂采用的配体有纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、交联葡聚糖、琼脂糖、交联琼脂糖、多孔玻璃珠等。,40,2020/5/22,根据配体对待分离物质的亲和性的不同，可以将其分为两类：特异性配体（specificligand）和通用性配体（generalligand）。特异性配体一般是指只与单一或很少种类的蛋白质等生物大分子结合的配体。如生物素和亲和素、抗原和抗体、酶和它的抑制剂、激素受体等，它们结合都具有很高的特异性，用这些物质作为配体都属于特异性配体。配体的特异性是保证亲和层析高分辨率的重要因素，但寻找特异性配体一般是比较困难的，尤其对于一些性质不很了解的生物大分子，要找到合适的特异性配体通常需要大量的实验。,41,2020/5/22,通用性配体一般是指特异性不是很强，能和某一类的蛋白质等生物大分子结合的配体，如各种凝集素（lectine）可以结合各种糖蛋白，核酸可以结合RNA、结合RNA的蛋白质等。通用性配体对生物大分子的专一性虽然不如特异性配体，但通过选择合适的洗脱条件也可以得到很高的分辨率。而且这些配体还具有结构稳定、偶联率高、吸附容量高、易于洗脱、价格便宜等优点，所以在实验中得到了广泛的应用。,42,2020/5/22,配基的浓度：（1）对亲和势比较低的时候（Kd10-4mol/L），增加配基浓度有利于吸附。（2）增加亲和柱的长度来提高吸附率。（3）配基浓度太高使吸附力太强，洗脱困难。（4）理想的配基浓度为1-10mol/L。,43,2020/5/22,配基偶联的位置：（1）配基固定化时，其不参与亲和结合的部位与载体进行偶联。（2）腺嘌呤N6-氨基接到载体上，对脱氢酶和甘油激酶有吸附力。（3）磷酸基接到载体上，对甘油醛-3-磷酸脱氢酶有吸附力。,44,2020/5/22,配基分子的大小：（1）选用大分子配基。（2）小分子物质作为配基，载体和配基间插入一个“手臂”以消除空间障碍。,45,2020/5/22,介质活化与耦联：基质的活化是指通过对基质进行一定的化学处理，使基质表面上的一些化学基团转变为易于和特定配体结合的活性基团。常用方法：（1）溴化氰活化法（2）环氧基活化法上面两种方法是比较常用的方法，另外还有甲苯磺酰氯法、双功能试剂法。,46,2020/5/22,（1）溴化氰活化法溴化氰活化法是最常用的活化方法之一，活化过程主要是生成亚胺碳酸活性基团，它可以和伯氨(NH2)反应，主要生成异脲衍生物。反应如下：,47,2020/5/22,48,2020/5/22,这种方法的缺点是溴化氰活化法的基质和配体偶联后生成的异脲衍生物中氨基的pKa10.4，所以通常会带一定的正电荷，从而使基质可能有阴离子离子交换作用，增大了非特异性吸附，影响亲和层析的分辨率。另外溴化氰活化的基质与配体结合不够稳定，尤其是当与小配体结合时，可能会出现配体脱落现象。另外溴化氰有剧毒、易挥发，所以操作不便。,49,2020/5/22,（2）环氧基活化法在热的浓碱溶液中，多糖类化合物与环氧氯丙烷作用生成环氧化合物；在碱性条件下，其环氧化合物又能与氨基酸或蛋白质上氨基偶联。,50,2020/5/22,这种活化方法的优点是活化后不引入电荷基团，而且基质与配体形成的NC、OC和SC键都很稳定，所以配体与基质结合紧密，亲和吸附剂使用寿命长，而且便于在亲和层析中使用较强烈的洗脱手段，另外这种处理方法没有溴化氰的毒性。它的缺点是用环氧氯丙烷活化的基质在与配体偶联时需要碱性条件，pH为9-13，温度为20-40。这样的条件对于一些比较敏感的配体可能不适用。,51,2020/5/22,常见的亲和色谱：（1）核苷酸及辅酶亲和色谱（2）固定化金属离子亲和色谱（3）染料亲和色谱（4）免疫亲和色谱（5）基团专一性大分子亲和色谱,52,2020/5/22,（1）核苷酸及辅酶亲和色谱：指将核苷酸（或辅酶）作为亲和配基固定在色谱介质上进行亲和色谱的技术，主要利用核苷酸特别是辅酶因子和蛋白质之间的专一性识别达到分离纯化目的。（2）固定化金属离子亲和色谱：蛋白质上的氨基酸残基，如组氨酸的咪唑基、半胱氨酸的巯基和色氨酸的吲哚基，有利于蛋白质与固定化金属离子结合，从而达到分离的目的。金属离子如锌和铜。将活化的介质与金属螯合剂偶联，再用金属离子溶液处理制成金属螯合亲和层析柱。,53,2020/5/22,（3）染料亲和色谱：有机染料具有类似于NAD+的结构，需核苷酸类物质为辅酶的酶，对染料具有一定亲和力，染料共价偶联到琼脂糖载体上，能制得亲和层析柱，染料亲和层析已成功的分离纯化了多种酶。（4）免疫亲和色谱：抗原和抗体的作用具有高度的专一性,并且它们的结合亲和力极强。因此用适当的方法将抗原或抗体结合到吸附剂上,便可有效地分离和纯化免疫物质。特点：分离效率高，成本高，而且蛋白质亲和配基不稳定，容易降解。,54,2020/5/22,（5）基团专一性大分子亲和色谱：指用对某一类结构相近的物质有亲和性的大分子作为亲和配基偶联在色谱介质上进行的色谱技术。例如：蛋白A亲和色谱伴刀豆球蛋白A亲和色谱肝素亲和色谱,55,2020/5/22,亲和色谱技术的应用：（1）t-PA的纯化酶的抑制剂为亲和配基（2）干扰素的纯化免疫亲和色谱（3）脱氢酶的纯化色素亲和色谱（4）淀粉酶抑制剂的纯化固定化金属离子亲和色谱（5）基因重组融合蛋白的纯化,56,2020/5/22,2、亲和过滤（膜分离）将亲和层析和膜过滤技术结合运用，包括亲和错流过滤和亲和膜分离。（1）亲和错流过滤（AffinityCrossFlowFiltration：ACFF）:是将亲和层析与超滤技术结合，高分子底物经专一可逆的亲和反应后，用膜进行错流过滤，兼有亲和层析与膜过滤的优点。,57,2020/5/22,亲和错流过滤过程：基质是聚合物组成的内核，亲和配基连接在内核表面。配基对提取的目标物进行专一可逆的吸附，形成复合体；用膜对混合液进行错流过滤，复合体因分子巨大可被保留，杂质随液体透过膜，目标物与其它成分分离。,58,2020/5/22,亲和错流过滤特点：以压差为传质推动力，速度快，易于放大；纯化水平可接近或达到亲和色谱；制备亲和过滤介质所用的载体一般为水溶性聚合物或无孔微粒，无内扩散传质阻力，目标分子的亲和结合速度快；与固定床型亲和色谱相比，亲和过滤操作中目标分子与亲和过滤介质的接触在全混槽中进行，最多只能达到一级吸附平衡，相当于色谱过程的一个理论塔板。采用多级串联亲和过滤操作可弥补这一缺点。,59,2020/5/22,（2）亲和膜分离：亲和膜利用亲和配基修饰的微滤膜为亲和吸附介质亲和纯化目标蛋白质，是固定床亲和层析的变型。将一张微滤膜比喻为一个固定床，膜厚为床层高度。亲和膜优点：传质阻力小，达到吸附平衡的时间短；配基利用率高，配基用量低；压降小，流速快；设备体积小。,60,2020/5/22,亲和配基固定在膜孔表面，流体在对流透过膜的过程中目标蛋白质与配基接触而被吸附。,亲和膜吸附原理示意图,61,2020/5/22,亲和色谱操作速度有限。一般采用径向放大的方式，才能保证色谱柱的处理量。如果色谱柱的体积一定，降低柱高而增大柱径即“短粗”型亲和色谱柱有利于提高分离速度。,62,2020/5/22,3、亲和萃取利用偶联亲和配基的PEG为成相聚合物进行的双水相萃取，在亲和配基的亲和结合作用下促进目标产物在PEG相（上相）的分配，提高目标产物的分配系数和选择性。体系：PEG/Dextran，PEG/无机盐,63,2020/5/22,近几年来，仅在PEG上可接的配基就有十多种，分离纯化的物质达几十种，产物的分配系数成百上千倍的提高，如用磷酸酯PEG磷酸盐双水相体系萃取-干扰素，分配系数由原来的1左右提高到630。,64,2020/5/22,4、亲和反胶团萃取（affinity-basedreversedmicellarextraction）：是指在反胶团相中除通常的表面活性剂（如AOT）以外，添加另一种亲水头部为目标分子的亲和配基的助表面活性剂（cosurfactant），通过亲和配基与目标分子的亲和结合作用，促进目标产物在反胶团相的分配，提高目标产物的分配系数和反胶团萃取分离的选择性的分离方法。,65,20