11DNA重组技术的工具2

基因工程,专题1,烟草,据WTO调查：2004年全世界因狂犬病致死人数约5.5万人中国卫生部通报：2004年月，狂犬病列法定报告传染病死亡数之首。发病死亡率近100%,能产生狂犬病抗体蛋白的转基因,每100kg猪或牛的胰腺中仅可提取45g。,1979年，美国将人的胰岛素基因重组到大肠杆菌内，实现了细菌生产胰岛素，大大降低了生产成本。,治疗糖尿病特效药,据WTO调查：2005年全世界约有糖尿病患者1.8亿人，我国约6000万。,胰岛素,思考：转基因技术实现了一种生物的某些性状在另一种生物中表达。这些性状的表达与我们学过的基因的什么过程有关？,密码子在生物界是的！,通用,定向基因改造设想,设想一,能否让禾本科的植物也能够固定空气中的氮？,能否让细菌“吐出”蚕丝？,设想二,能否让微生物产生出人的胰岛素、干扰素等珍贵的药物？,设想三,基因工程的产物,基因工程，又叫DNA重组技术。是指按照人们的愿望，在DNA分子水平上进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。,基因工程概念,基因工程的概念,DNA重组技术,生物体外,基因,DNA分子水平,人类需要的新生物类型和产品,剪切,拼接,导入,表达,早期基础理论,1859年达尔文提出生物进化论,科技探索之路,基础理论和技术发展催生了基因工程,1900年孟德尔基因分离定律和自由组合定律的再度提出,早期基础理论,科技探索之路,基础理论和技术发展催生了基因工程,1910年摩尔根证明基因在染色体上，并提出基因的连锁互换定律,早期基础理论,科技探索之路,基础理论和技术发展催生了基因工程,1944年艾弗里证明DNA是遗传物质DNA可从一种生物个体转移到另一种生物个体,后期基础理论,科技探索之路,基础理论和技术发展催生了基因工程,1953年沃森、克里克提出DNA的双螺旋结构模型,后期基础理论,科技探索之路,基础理论和技术发展催生了基因工程,1958年梅塞尔松、斯塔尔证明DNA的半保留复制,后期基础理论,科技探索之路,基础理论和技术发展催生了基因工程,1958年克里克等提出中心法则,后期基础理论,科技探索之路,基础理论和技术发展催生了基因工程,1963年尼伦伯格和马太破译编码氨基酸的遗传密码，1966年霍拉纳用实验加以证明。,后期基础理论,科技探索之路,基础理论和技术发展催生了基因工程,科技探索之路,基础理论和技术发展催生了基因工程,技术发明,1967年基因转移载体的发现1970年工具酶的发现1965年氨基酸测序和1977年DNA测序技术的发明1972年DNA体外重组的实现1973年重组DNA表达实验的成功1980年第一例转基因动物和1983年第一例转基因植物问世1988年PCR技术的发明,实现了一种生物的某些性状在另一种生物中的表达。,专题一基因工程(geneengineering),1.1DNA重组技术的基本工具,温故知新,培育转基因抗虫棉的简要过程,棉花细胞(不能抗虫),抗虫基因,转基因抗虫棉(能抗虫),苏云金芽孢杆菌,目的基因,与运载体DNA拼接,导入,剪刀,针线,运载体,检测表达,受体细胞,分子手术刀,分子缝合针,分子运输车,主要来源于原核生物,命名：属名头字母（大写）+种名头2字母+菌株名（通常省略）+罗马数字,一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的位点切割DNA分子。,专一性,大多数限制酶的识别序列由个核苷酸组成少数的识别序列由个核苷酸组成,6,4、5或8,产生黏性末端或平末端,种类：现已从300微生物中分离出约4000种限制酶,一、基因工程的基本工具,1、分子手术刀限制（性核酸内切）酶,脱氧核苷酸的结构,G,1,2,3,4,5,A,磷酸二酯键,3端,5端,3端,5端,磷酸二酯键,3,5,限制酶的识别序列,一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列,在G与A之间切割,大肠杆菌的一种限制酶(EcoR)只能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。,例1：EcoRI限制酶,黏性末端,黏性末端,被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。,EcoRI限制酶的切割,SmaI限制酶只能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切开。,例2：SmaI限制酶,在G与C之间切割,平末端平末端,当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。,SmaI限制酶的切割,黏性末端,练习使用EcoRI剪切目的基因,模型构建3,为什么限制酶主要是在原核生物中提取的？你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是是什么吗？要想获得某个特定性状的目的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性(平)末端？要切两个切口，产生四个黏性(平)末端。如果把两种来源不同的DNA用同种限制酶来切割，会怎样？会产生相同的黏性(平)末端如果把具有相同黏性(平)末端的DNA连接起来，又会怎样呢？得到重组DNA,寻根问底,E.coliDNA连接酶,T4DNA连接酶,只作用于末端,主要作用于末端，还可作用于末端,DNA片段,形成磷酸二酯键,黏性,平,黏性,通过形成新的磷酸二酯键，而将两条DNA的“扶手缝隙”连接起来，形成重组DNA,一、基因工程的基本工具,2、分子缝合针DNA连接酶,把切下来的DNA片段拼接成新的DNA，即将脱氧核糖和磷酸连接起来催化形成磷酸二酯键,DNA连接酶的作用,两DNA片段要具有互补的黏性末端才能拼起来,DNA连接酶的缝合作用,可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，,注意：DNA连接酶可连接双链DNA中的DNA单链缺口，但不能连接单链DNA！,DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？,T4DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率较低,DNA连接酶的缝合作用,DNA连接酶与DNA聚合酶作用的比较,单,双,不要,要,2个DNA片段,单个脱氧核苷酸加到已存在的单链DNA片段上,磷酸二酯,限制性内切酶的识别序列和切点是GGATCC，限制性内切酶的识别序列和切点是GATC。在质粒上有酶的一个切点，在目的基因的两侧各有一个酶的切点。（1）请画出质粒被限制酶切割后所形成的黏性末端。（2）请画出目的基因两侧被限制酶切割后所形成的黏性末端。（3）在DNA连接酶作用下，上述两种不同限制酶切割后形成的黏性末端能否连接？为什么？,可以连接。因为由两种不同限制酶切割后形成的黏性末端是相同的（或是可以互补的）,小试身手,DNA1,重组DNA,练习使用DNA连接酶制作重组DNA分子,模型构建4,由于切割后的载体和目的基因具有相同的末端，故重组DNA存在3中可能连接。即、。,重组DNA一定是载体-目的基因连接吗？,载体-目的基因,载体-载体,目的基因-目的基因,载体的作用,载体的必要条件,载体的种类,阅读课本第6页“分子运输车”运载体的相关内容，填写下表,自主学习,1）能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。2）具多个限制酶切点，以便与外源基因连接。3）具有某些标记基因，便于进行鉴定和选择。4）必须是安全的，对受体细胞无害。5）载体DNA分子应大小适中，以便于提取和操作,1）作为运载工具，将目的基因导入受体细胞中2）在受体细胞内对目的基因进行大量复制,细菌的质粒病毒：噬菌体衍生物、动植物病毒等。,将外源基因送入受体细胞,具有特殊的标记基因，便于进行筛选；,质粒、噬菌体和动植物病毒,存在于细菌及酵母菌等微生物中，,核DNA以外能自我复制的小型环状DNA分子,对受体细胞无害,具有多个限制酶切点，以便与外源基因插入其中；,能够在宿主细胞中复制并稳定地保存；,载体能对受体细胞有害吗？,载体怎样才能具有能连接不同目的基因的潜能呢？,目的基因怎样才能在受体细胞分裂时不被丢失从而稳定地存在于子细胞内，同时获得更多所需要的产品呢？,目的基因是否进入受体细胞，你如何察觉？,一、基因工程的基本工具3.分子运输车载体,分子手术刀,限制（性核酸内切）酶,分子缝合针,DNA连接酶,分子运输车,质粒、病毒等,基因工程的原理,小结,基因的“剪刀”,基因的“针线”,基因的运载体,1.下列是由限制酶切割形成的DNA片段，能用相应DNA连接酶将它们恢复连接的组合是（）,CTGCAG,G,CTTAA,G,ACGTC,AATTC,G,A.；B.；C.；D.以上都不对,A,小试牛刀,2.如图，就下列与核酸相关酶的作用机理填空：限制酶解旋酶DNA连接酶DNA聚合酶RNA聚合酶,A.切断a处的酶为_B.连接a处的酶为_C.切断b处的酶为_D.连接b处的酶为_,无,小试牛刀,3.有关基因工程的叙述正确的是（）A、限制酶只在获得目的基因时才用B、重组质粒的形成在