流式细胞仪原理和一般用法

、partec-excelectenceinflowcytometry、contritynetsnewdoptrodentmentsinmedicaldiagnosisandmicrobiogy德国partec公司中国服务中心张阳阳partec-excelenceinflowcytometry，41年以上的研发经验，流式细胞仪原理流式细胞仪采用一般的方法和技术， partec-excellenceinflowcytometry，41年以上的研究开发经验，也被称为流式细胞术、流式细胞术、流式细胞术(flowcytometry，FCM )，在高速流动的状态下，对被荧光色素染色的单细胞和微粒子进行高能量是一种现代的细胞分析技术，通过测定其产生的散射光和荧光强度，定性定量测定细胞(或微粒)的物理、生理、生化、免疫、遗传、分子生物学性状和功能状态等。 他综合了激光技术、计算机技术、半导体技术、流体力学、细胞化学等学科。 又称、partec-excellenceinflowcytometry、41年以上的研发经验、流式站点测量法、流式站点测量法(flowcytometry，FCM )， 是一种现代细胞分析技术，用高能量激光照射在高速流动的状态下被荧光色素染色的单细胞和微粒子，通过测定其产生的散射光和荧光的强度，定性定量地测定细胞(或微粒子)的物理、生理、生化、免疫、遗传、分子生物学性状和功能状态等。 他综合了激光技术、计算机技术、半导体技术、流体力学、细胞化学等学科。、partec-excellenceinfolowcytometry有41年以上的研发经验，特点： (1)单细胞分析。 (二)快速分析。 (3)多参数相关测量。 (4)对细胞进行定性或定量分析。 (5)统计学意义明显。 (六)筛选。、partec-exectlenceinfolowcytometry，41年以上的研究开发经验，荧光，一些物质在照射光时，吸收其波长的光，发出与各种颜色不同强度的光，如果不照射光，其发出的光也消失，将该发出的光荧光荧光的波长比吸收光的波长长。 被物质的分子构造吸收的光和被放出的荧光波长不同。 被这些物质吸收的光被称为激发光，产生的发光是荧光。 荧光的颜色多为红、蓝、绿、黄等。 物质的荧光有2种，一种是自发的荧光，也就是组织在短波长的光照射下自发的荧光。 例如，组织中的蛋白质和脂质在紫外线的照射下会发出微弱的淡蓝色荧光。 另一种荧光是在细胞与荧光染料结合之后，通过照射特定波长的光而发出的荧光。 常用的诱发荧光，产生荧光的生物染色剂叫做荧光染料(或荧光色素)。，partec-execlenceinfolowcytometry，41年以上的研究开发经验，荧光激发和发射原理，能量水平，partec-execlenceinfolowcytometry，41年以上的研究开发免疫荧光技术将荧光素标记在基于抗原-抗体反应原理的已知抗原或抗体上，制成荧光抗原或抗体，将该荧光抗体(或抗原)作为探针检测细胞表面或细胞内的对应抗原(或抗体)。 含有形成的抗原抗体复合体上标记的荧光素，用流式细胞仪检测标本，荧光素受到外来激发光的照射，产生明亮的荧光(如黄、绿、红等)，通过决定抗原和抗体的性质、定位来推定细胞信息，利用定量技术测定含量。 常用方法：partec-exectelectenlecinflowcytometry，41年以上的研究开发经验，DAPI，Hester，PI等嵌入性染料与细胞内DNA双螺旋结构中的A-T碱基对直接结合，细胞在激发光的照射下发出特定波长的光，partec-excellenceinflowcytometry，41年以上的研究开发经验，细胞膜电位，离子，脂质探针发现或开发了各种细胞膜电位，各种离子，pH值，脂质探针，使用这些探针在流式细胞仪表上进行了相同的研究有关详细信息，请参见细胞探测公司网站www.molecularP，partec-excellenceinfolowcytometry。 41年以上的研发经验，流式细胞仪相关荧光术语，mesf (molecullesofequivalentsolblefluorochidrome )等量可溶性荧光分子：国际标准单位，荧光强度自发荧光：细胞和粒子受激照射时发出各种波长的荧光。 白细胞自发荧光强度为6501150MESF，血小板及其他粒子自发荧光更低的流式细胞仪精度：分析白细胞时精度在600MESF以内，分析其他细胞及粒子时需要更高的精度： 200MESF以内， partec-excellenceinflowcytometry超过了41年的研究开发经验，常见的荧光色素列表，partec-excelenceinflowcytometry，41年以上的研究开发经验，常见的荧光色素列表， partec-excelenceinflowcytometry，41年以上的研究开发经验， 常用荧光色素种类488nm蓝色激光激发： FITC (异硫氰酸酯荧光体):绿色530nmPE (海藻酸红蛋白):橙色575nmPE-Cy5(PE的衍生物):红色665nmPerCP (聚甲基环状叶绿素蛋白):红色675nmPI (碘：橙色620nm637nm红色激光激发： APC (别名海藻酸兰蛋白):红色665nmAPC-Cy5(别藻兰蛋白的衍生物):品红色710nm365nm紫外光激发： dapi(4， 6-甲基-2-联苯吲哚):蓝455nm532nm绿色激光激发： PE (藻红蛋白):橙色575nmPE-Dy647(PE的衍生物):红647nmPE-Cy5(PE的衍生物):红665nm， partec-excelenceinfolowcytometry是41年以上的研发经验，流式细胞仪的原理概述，流式细胞仪(FlowCytometer简称FCM )是自动分析细胞的高级技术设备，其原理是液体中悬浮的细胞依次通过测量区域当每个细胞穿过测量区域并且用激发光照射时，会产生光信号，由光电倍增管(PMT )将该信号转换为电信号，并且这些信号可以表示荧光、正常光散射、光吸收或者细胞阻抗。 这些信号被测量、记忆和显示，细胞的一系列重要物理和生化特征被迅速、大量地测量。 上述特征包括细胞大小、活性、核酸数量、酶、抗原等。 机器也可以根据规定的参数，从整个集团中筛选出指定的细胞亚群。、partec-excellenceinflowcytometry，41年以上的研发经验，流式细胞仪的原理，测定对象细胞调制成单一细胞的悬浊液，用特异的荧光染料染色后，放入样品管，在气体压力下进入流动室。 流动室内充满了护套液，被护套液束缚，细胞排成一列，从流动室的喷嘴喷出，形成细胞液柱。 液柱与入射的激光束垂直相交的点称为测量区域。 通过测量区域的细胞被激发产生荧光。 在与入射光束或液晶柱垂直的方向上配置用于收集荧光信号的光学系统(透镜、光圈、滤波器、检测器等)。 光电倍增管将收集到的光信号转换成电信号，将该电信号传送给计算机，计算机在相应的软件中将电信号模拟成图像。 流动池(FlowCuvette或FlowCell )是仪器的核心部件，在此测量样品与激光器相交。 流化室由石英玻璃制成，在石英玻璃中央开孔径350250um的长方形孔，使细胞单一流动，检测区位于该孔的中心，该流化室的光学特性良好，流速慢，细胞照射时间长，可收集的细胞信号光束大，配合广角的收集透镜，检测灵敏度高流动室内充满鞘液，鞘液的作用是包裹样品流。套管流是稳定的流体，作业者不能随意改变流速。 样本流在鞘流环包下形成流体力学聚焦，使样本流不离开流的轴线方向，结合样本喷嘴的特殊结构，保证各细胞通过激光照射区域的时间相等，得到正确的细胞信息(散射光和荧光)。，41年以上的研究开发经验，激光器，488nm，FL2PE，SSC，FSC，液路，电子部件部分，FL3PerCP，Cy5，FL1FITC，FL3PerCP，Cy5，FL1FITC， partec-excelenceinflowcytometry，41年以上的研究开发经验，流式细胞仪的结构，流式细胞仪和流式细胞驱动系统激光光源和光束形成系统(滤波器组)信号检测和存储系统显示，分析系统： partec-excellenceinflowcytometry，41年以上的研发经验，激光提供了单波长、高强度和稳定性高的光，是快速分析细胞微弱荧光的理想光源。 这是因为细胞迅速流动，细胞通过光照射区域的时间只有1微秒左右，细胞所具有的荧光物质被激发的荧光信号的强弱与照射时间和激发光的强度有关系，因此细胞需要足够的光照射强度。 激光束在到达流动室之前穿过透镜，并将其聚焦以形成其中短轴略大于细胞直径的光斑(几何尺寸)。 这种椭圆点激光器的能量分布必须与激光束正交，并与激光能量分布的峰值相交，以确保正态分布样品中的细胞分别受光，照射强度充分一致。 桌面FCM的光路调节对用户来说是关闭的。 即，设置时工程师调整后用户不需要调节，因此用户的操作非常方便。、partec-excellenceinflowcytometry，41年以上的研发经验，光学系统、流式细胞仪光学系统由若干透镜、滤光器、小孔构成，分别将不同波长的荧光信号发送给不同的电子检测器。 在流式细胞仪的光学系统中主要的光学原稿是滤波器，主要分为三类：长通滤波器LP短通滤波器SP带通滤波器BP，partec-excellenceinflowcytometry超过了41年的研究开发经验像LP500滤波器一样，500nm以上的光通过，500nm以下的光吸收或返回。 与、partec-exectlenceinfolowcytometry、41年以上的研究开发经验、短通滤波器、长通滤波器相反，特定波长以下的光通过，特定波长以上的光被吸收或返回。、partec-exectlenceinfolowcytometry，41年以上的研究开发经验，带通滤波器、带通滤波器能够允许相当窄的波长范围的光通过，一般的滤波器有两个个数，一个是允许通过的波长的中心值，另一个是允许通过的波长的中心值像BP500/50那样可通过的波长范围是475nm525nm。、partec-exectlenceinfolowcytometry具有41年以上的研发经验，信号的检测与分析，细胞具有荧光标记物，当通过激光照射区域时，被激光激发，产生细胞内不同物质、表示不同波长的荧光信号发射到空间的360度的立体角，产生散射光和荧光信号的下图是以激发光光源波长488nm为例的示意图：partec-excellenceinfolowcytometry，有41年以上的研究开发经验，1 .散射光信号：散射光为前方角散射(FSC， 分为前向散射和侧向散射(SSC，SideScatter )，散射光称为细胞的物理参数(或固有参数)，因为散射光不依赖于细胞样本的制造技术(例如染色)。 (1)前向角散射：表示细胞体积的大小，前向角散射与待测细胞的大小有关，准确地说与细胞直径的平方有密切关系。 在FCM应用中，选择FSC作为阈值，排除样品中的各种碎片和鞘液中的小粒子，避免对被测细胞的干扰。(2)侧向散射：表示细胞内容物的量(或密度)，侧向散射是指与激光束正交的900个方向的散射光信号，侧向散射光对细胞膜、细胞质、核膜的折射率敏感，可提供细胞内微结构和粒子性质的相关信息。 2 .荧光信号：激光束与细胞正交时，一般产生两种荧光信号。 一种是细胞本身通过激光照射发出微弱的荧光信号，另一种称为细胞自发荧光，是用特异的荧光素标记细胞后激发照射而得到的荧光信号，通过这种荧光信号的检测和定量分析，可以得知研究的细胞参数的存在和定量。，partec-execlenceinfolowcytometry，41年以上的研究开发经验，光电倍增管如何产生电压脉冲信号，partec-execlenceinfolowcytometry，41年，时间(s )，电压，脉冲面积(a )，脉冲高度(h )，脉冲宽度(w )，40，0， partec-excellenceinflowcytometry拥有41年以上的研究开发经验，脉冲信号的宽度和面积通常用于识别双粘体细胞。41年以上的研究开发经验，阈值：阈值用于定义光电倍增管识别的最小或最大信号强度、partec-excellenceinflowcytometry，41年以上的研发经验，荧光信号的线性测量和对数测量，线性放大：即放大器的输出和输入呈线性关系，细胞DNA含量、RNA含量、总蛋白质含量等测量一般采用线性放大测量。 对数放大：也就是说，由于放大器的输出是10倍的关系，原来的输出是1，当输入增加到原来的10倍时，输出是2，当输入增加到原来的100倍时，输出是3，等等。 免疫学样品中细胞膜表面抗