第二节基因工程的原理和技术.ppt

基因工程的基本原理和技术,选修三第1章,1.1DNA重组技术的基本工具,抑制疾病传播的转基因蚊子,巴西等拉美国家深受致倦库蚊的危害。致倦库蚊可携带多种病毒和寄生虫，能够传播脑炎、丝虫等传染病，而这些传染病常年在拉美国家肆虐。为了抑制疾病的传播，巴西科学家培育出了一种转基因雄性致倦库蚊。科学家在雄性致倦库蚊体内植入一种特殊基因，当具该基因的转基因雄蚊与野生雌蚊交配时，这种基因可以进入雌蚊的基因组，并使雌蚊死亡，从而减少了该种蚊子的数量，达到抑制疾病传播的目的。怎样才能最终得到转基因雄蚊呢？,基因工程,基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。又叫DNA重组技术。原理：,基因重组,1.限制性核酸内切酶,来源：功能：末端形式：,主要是从原核生物中分离纯化出来的,识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列并使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开,产生黏性末端或平末端,黏性末端,平末端,EcoRI,SmaI,2.DNA连接酶,作用：种类：,恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键以连接运载体和目的基因,比较多种酶,为什么限制酶不切割自身DNA？DNA连接酶起作用时需要模板？,DNA连接酶和DNA聚合酶的异同,同：都连接双链DNA的缺口，而不能连接单链DNA；都是形成磷酸二酯键；都是由蛋白质构成的酶异：DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段上，而DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键；DNA聚合酶是以一条DNA链为模板，DNA连接酶不需要模板。,3.“分子运输车”-运载体,作用：常用运载体：具备条件：,作为运载工具,将目的基因转移到宿主细胞内；携带目的基因在宿主细胞内进行大量复制,质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒等,能在宿主细胞内稳定保存并大量复制；有多个限制酶切割位点，以便与外源基因连接；具有特殊的标记基因，以便进行筛选;对受体细胞无毒害作用，否则受体细胞将受到损伤甚至死亡,化学本质：环状双链DNA小分子,下表是外源基因插入位置（插入点有a、b、c），请根据表中提供细菌的生长情况，推测三种重组后细菌的外源基因插入点，正确的一组是：,A是c；是b；是aB是a和b；是a；是bC是a和b；是b；是aD是c；是a；是b,A,目的基因如果插入某抗性基因中，将使该基因失活，而不再具有相应的抗性。,二、基因工程的基本操作程序,4个步骤：目的基因的获取；基因表达载体的构建；将目的基因导入受体细胞；目的基因的检测与鉴定,1.目的基因的获取,目的基因：主要是指编码蛋白质的基因目的基因的获取的方法:从基因文库中获取目的基因利用PCR技术扩增目的基因通过化学方法人工合成目的基因,1.目的基因的获取,从基因文库中获取基因文库：,将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因。,基因组文库,部分基因文库（cDNA文库）,含有一种生物所有的基因,含有一种生物的一部分基因,将DNA片段与载体连接,适当的限制酶酶切,1.目的基因的获取,基因组文库,直接分离法,提取某种生物的全部DNA,一定大小的DNA片段,重组载体,基因组文库,导入受体菌中储存,基因组文库,与载体连接,逆转录酶,1.目的基因的获取,逆转录法,提取某种生物的某器官或特定发育时期的mRNA,单链DNA,双链cDNA片段,重组载体,cDNA文库,DNA聚合酶,导入受体菌中储存,杂交双链(RNA-DNA),1.目的基因的获取,基因组文库部分基因文库,某生物体内全部DNA,许多DNA片段,受体菌群体,某种生物某个时期的mRNA,cDNA,受体菌群体,反转录法,直接分离法,基因组文库部分基因文库,cDNA是反转录DNA，为什么不能包括全部基因？,生物的不同发育阶段，基因并不是都能表达，而是选择性表达，即只表达部分基因，所以只能得到部分基因的mRNA，只能反转录成部分基因。,为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗？cDNA是反转录DNA，为什么不能包括全部基因？,当不知DNA碱基序列时，或只知道目的基因序列的一段，或要得到这种生物的全部基因，或是想从某种生物中获得多个基因或是想了解某种生物在不同发育阶段表达的基因有什么不同，就要构建基因文库,生物的不同发育阶段，基因并不是都能表达，而是选择性表达，即只表达部分基因，所以只能得到部分基因的mRNA，只能反转录成部分基因。,启动子：具有启动作用的DNA片段。RNA聚合酶识别结合的部位，基因的首端，有了它才能转录出mRNA；终止子：一段有特殊结构的DNA片段，基因的尾端，RNA聚合酶转录的终止信号,与RNA聚合酶结合位点,无内含子,内含子：位于编码蛋白质序列的非编码DNA片段被转录，但在mRNA加工过程中被剪切掉，成熟mRNA上无内含子编码序列；外显子：位于编码蛋白质序列的编码DNA片段被转录，存在于成熟mRNA序列。真核细胞的基因在表达过程中能编码蛋白质的核苷酸序列,原核生物无内含子,1.目的基因的获取,从基因文库中获取,为什么cDNA文库没有启动子和内含子？,有一段已知目的基因的序列，以便根据这一序列合成,1.目的基因的获取,利用PCR技术扩增目的基因PCR技术：优点：,在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。,原理：,利用DNA双链复制的原理，将基因的核苷酸序列不断地加以复制，使其数量呈指数方式增加,前提：,核苷酸,引物,多聚酶链式反应,可以在短时间内大量扩增目的基因,体内DNA复制,特点：条件：,原料模板能量酶,4种游离的脱氧核苷酸DNA的两条链ATP提供能量解旋酶、DNA聚合酶,边解旋边复制;半保留复制,DNA聚合酶如何起作用？,不能从头开始合成DNA，只能从3端延伸DNA链,3,5,磷酸二酯键,5,3,复制方向：5到3,DNA复制,3,5,5,3,复制方向,引物：一小段单链DNA或RNA，与目的基因起始段互补,延伸方向5端到3端,PCR扩增过程,（90-95）：双链DNA模板在热作用下，_断裂，形成_；,（退火55-60）：温度降低，引物与单链DNA模板结合，形成局部_；,（70-75）：在酶的作用下，合成与模板互补的_；,氢键,单链DNA,双链,DNA链,重复,变性,复性,延伸,TaqDNA聚合,PCR扩增仪,利用PCR技术扩增目的基因,过程：,变性,退火/复性,延伸,循环,利用PCR技术扩增目的基因,结果：每一次循环后，目的基因的量可以，即成指数形式扩增(约为，n为扩增循环次数),增加一倍,2n,利用PCR技术扩增目的基因,条件：,能量,4种游离的脱氧核苷酸,耐高温的TaqDNA聚合酶,不需要ATP提供能量,原料,模板,酶,DNA的两条链,引物,两种,缓冲液,控制温度,控制PH值,人工控制（PCR扩增仪进行控制）,练一练,第几次扩增，才能从DNA链上完整地扩增出目的基因？,1.目的基因的获取,人工合成目的基因,基因比较小,核苷酸序列已知,DNA合成仪,练习,1.判断正误：(1)目的基因可以从自然界已有物种中直接分离，也可人工合成()(2)目的基因就是指编码蛋白质的基因()(3)真核生物的基因中含有内含子，因此常用反转录法获取目的基因()(4)一种生物的cDNA文库可以有许多种，但基因组文库只有一种。()(5)常用卵细胞作为动物的受体细胞。(),2.下列获取目的基因的方法中需要模板链的是()从基因文库中获取目的基因利用PCR技术扩增目的基因反转录法通过DNA合成仪利用化学方法人工合成A.B.C.D.,D,-单链DNA为PCR扩增的模板,-mRNA为模板,练习2,(1)PCR技术的原理是_，A过程表示_;催化C过程的酶是;利用PCR技术获取目的基因的前提是_。(2)某样品DNA中共含3000个碱基对，碱基数量满足：(AT)(GC)1/2，现欲得到100个与样品相同的DNA，至少需要向试管中加入_个腺嘌呤脱氧核苷酸。,99000,DNA双链复制,DNA解旋,要有一段已知目的基因的核苷酸序列,热稳定DNA聚合酶,2.基因表达载体的构建,-核心,同一种限制酶,DNA连接酶,2.基因表达载体的构建,(1)目的：(2)基因表达载体的组成：,-核心,是使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代；使目的基因能够表达和发挥作用；,启动子+目的基因+终止子+标记基因(+复制原点),-目的基因在启动子和终止子之间,2.基因表达载体的构建,启动子：是识别和结合的部位，驱动基因转录出；是转录的；终止子：转录的；使在所需要的地方停止下来；目的基因：控制特定的性状；标记基因：鉴定受体细胞中是否含有，从而将含有目的基因的细胞筛选出来,RNA聚合酶,mRNA,起点,-核心,终点,转录,目的基因,VS起始密码子VS复制原点,为什么要构建基因表达载体？为什么不能将目的基因直接导入受体细胞？答：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。使目的基因能够表达和发挥作用。目的基因一定是经过限制酶切割过的基因，那么其结构已经不完整，缺少启动子等调控序列，不可能在受体细胞中表达和发挥作用，会作为异物被分解或排出。,3.将目的基因导入受体细胞,转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内_的过程。导入方法及受体细胞：,维持稳定和表达,3.将目的基因导入受体细胞,导入植物细胞的常用方法：,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,导入植物细胞,最常用,双子叶/裸子,单子叶,我国独创,体细胞,农杆菌转化法,农杆菌特性：易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力；T-DNA的作用：农杆菌转化法的作用机理：,可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上,概念,cDNA：complementaryDNA一种互补脱氧核糖核酸。与mRNA链互补的单链DNA，以其mRNA为模板，在适当引物的存在下，由mRNA与DNA进行一定条件下合成的，就是cDNA。Ti质粒：英文肿瘤诱发（tumor-inducing）缩略式。根瘤土壤杆菌细胞中存在的一种染色体外自主复制的环形双链DNA分子。此质粒既有在细菌中表达的基因，又有在高等植物中表达的基因；T-DNA：（TransferDNA）即转移DNA是Ti质粒上的一个片断，可插入到植物基因组中。农杆菌侵染植物后，Ti质粒中的T-DNA区段脱离质粒而整合到受体植物的染色体上。具有向植物细胞传递外源基因的能力，而细菌本身并不进入受体细胞。,根瘤,冠瘿瘤,由细菌感染引起的肿瘤；与T-DNA的表达有关,基因枪法,目的基因包裹在微小的金粒或钨粒表面用基因枪高速射入到受体细胞或组织中目的基因表达,成本较高，是单子叶植物中常用的基因转化方法,花粉管通道法,含目的基因的溶液滴加在柱头上(或用含目的基因的溶液处理花粉粒)花粉粒吸入目的基因授粉目的基因表达,简便经济，我国科学家独创,3.将目的基因导入动物细胞,方法：过程：提纯基因表达载体体外显微注射入受精卵受精卵移植,显微注射技术,显微注射技术,最为有效、最常用将目的基因导入动物细胞的方法,3.将目的基因导入微生物细胞,方法：过程：Ca2+处理细胞感受态细胞重组表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA选择原核生物作为受体细胞的原因：,感受态细胞法,简便、经济、有效,繁殖快多为单细胞遗传物质相对较少,(Ca2+处理法),感受态细胞：细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,4.目的基因的检测与鉴定,1.(1)检测转基因生物的染色体DNA上有无目的基因：(2)检测目的基因是否转录出了mRNA：(3)检测目的基因是否翻译成蛋白质：2.包括抗虫、抗病的实验，以确定是否具有抗性及抗性的程度,DNA分子杂交技术,分子杂交技术,抗原抗体杂交法,分子水平的检测,接种,个体水平鉴定,4.目的基因的检测与鉴定,基因探针,定义：是一段带有检测标记，且顺序已知的，与目的基因互补的核酸序列(DNA或RNA)；【基因探针是用放射性同位素或荧光标记的目的基因的单链DNA片段。】至少必须具备以下两个条件：应是单链，若为双链，必须先行变性处理；应带有容易被检测的标记；,2017全国卷1真核生物基因中通常有内含子，而原核生物基因中没有，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。已知在人体中基因A（有内含子）可以表达出某种特定蛋白（简称蛋白A）。回答下列问题：（1）某同学从人的基因组文库中获得了基因A，以大肠杆菌作为受体细胞却未得到蛋白A，其原因是_。（2）若用家蚕作为表达基因A的载体，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用_作为载体，其原因是_。（3）若要高效地获得蛋白A，可选用大肠杆菌作为受体，因为与家蚕相比，大肠杆菌具有_（答出两点即可）等优点。,2017全国卷1真核生物基因中通常有内含子，而原核生物基因中没有，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。已知在人体中基因A（有内含子）可以表达出某种特定蛋白（简称蛋白A）。回答下列问题：（4）若要检测基因A是否翻译出蛋白A，可用的检测物质是_（填“蛋白A的基因”或“蛋白A的抗体”）。（5）艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明DNA是遗传物质做出了重要贡献，也可以说是基因工程的先导，如果说他们的工作为基因工程理论的建立提供了启示，那么，这一启示是_。,2017全国卷1真核生物基因中通常有内含子，而原核生物基因中没有，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。已知在人体中基因A（有内含子）可以表达出某种特定蛋白（简称蛋白A）。回答下列问题：（1）某同学从人的基因组文库中获得了基因A，以大肠杆菌作为受体细胞却未得到蛋白A，其原因是_。（2）若用家蚕作为表达基因A的载体，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用_作为载体，其原因是_。（3）若要高效地获得蛋白A，可选用大肠杆菌作为受体，因为与家蚕相比，大肠杆菌具有_（答出两点即可）等优点。,基因A有内含子，在大肠杆菌中，其初始转录产物中与内含子对应的RNA序列不能被切除，无法表达出蛋白A,噬菌体,噬菌体的宿主是细菌，而不是家蚕,繁殖快、容易培养,2017全国卷1真核生物基因中通常有内含子，而原核生物基因中没有，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。已知在人体中基因A（有内含子）可以表达出某种特定蛋白（简称蛋白A）。回答下列问题：（4）若要检测基因A是否翻译出蛋白A，可用的检测物质是_（填“蛋白A的基因”或“蛋白A的抗体”）。（5）艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明DNA是遗传物质做出了重要贡献，也可以说是基因工程的先导，如果说他们的工作为基因工程理论的建立提供了启示，那么，这一启示是_。,蛋白A的抗体,DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体,38生物选修3：现代生物科技专题（15分）几丁质是许多真菌细胞壁的重要成分，几丁质酶可催化几丁质水解。通过基因工程将几丁质酶基因转入植物体内，可增强其抗真菌病的能力。回答下列问题：（1）在进行基因工程操作时，若要从植物体中提取几丁质酶的mRNA，常选用嫩叶而不选用老叶作为实验材料，原因是_。提取RNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目的是_。（2）以mRNA为材料可以获得cDNA，其原理是_。,38生物选修3：现代生物科技专题（15分）几丁质是许多真菌细胞壁的重要成分，几丁质酶可催化几丁质水解。通过基因工程将几丁质酶基因