HE染色技术PPT课件

.,1,HE染色技术,.,2,主要内容,一、HE染色原理二、试剂三、染色步骤四、注意事项五、几种常见的染色问题,.,3,一、HE染色的原理及分类,1、HE染色的原理苏木精伊红染色法(hematoxylin-eosinstaining)，简称HE染色法，是普通光学显微镜观察与鉴别细胞凋亡与细胞坏死的一种染色方法，石蜡切片技术里常用的染色法之一。苏木精染液为碱性，主要使细胞核内的染色质与胞质内的核糖体着紫蓝色；伊红为酸性染料，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。HE染色是组织学、胚胎学、病理学教学与科研中最基本、使用最广泛的技术方法.,.,4,HE染色原理,苏木素,苏木红,蓝色色精,分化和蓝化,氧化,+铝,细胞核,负电荷色酸（染料有色部分）,伊红,染色,染色,正负电荷的极性吸附,正电荷色酸（染料无色部分）,水解,渗透作用或者弥散作用完成,.,5,HE染色分类,易于被碱性或酸性染料着色的性质称为嗜碱性(basophilia)和嗜酸性(acidophilia)；而对碱性染料和酸性染料亲和力都比较弱的现象称为中性（neutrophilia)。组织内的蛋白质构成蛋白质的氨基酸的种类很多，它们有不同的等电点。在普通染色法中，染色液的酸碱度为pH6左右，细胞内的酸性物质如细胞核的染色质、腺细胞和神经细胞内的粗面内质网及透明软骨基质等均被碱性染料染色，这些物质称为嗜碱性。而细胞质中的其它蛋白质如红细胞中的血红蛋白、嗜酸粒细胞的颗粒及胶原纤维和肌纤维等被酸性染料染色，这些物质称为嗜酸型。如果改变染色液的酸碱度，pH值升高时，则原来被酸性染料染色的物质可变为嗜碱性；pH值降低时，原来被碱性染料染色的物质则可变为嗜酸性。所以说染色液的pH值可以影响染色的反应。,.,6,脱氧核糖核酸（DNA）两条链上的磷酸基向外，带负电荷，呈酸性，很容易与带正电荷的苏木精碱性染料以离子键结合而被染色。苏木精在碱性溶液中称蓝色，所以细胞核被染成蓝色。伊红Y是一种化学合成的酸性染料，在水中离解成带负电荷的阴离子，与蛋白质的氨基正电荷的阳离子结合使胞浆染色，细胞浆、红细胞、肌肉、结缔组织、嗜伊红颗粒等被染成不同程度的红色或粉红色，与蓝色的细胞核形成鲜明对比。伊红是细胞浆的良好染料。由于组织或细胞的不同成分对苏木精的亲和力不同及染色性质不一样。经苏木精染色后，细胞核及钙盐粘液等呈蓝色，可用盐酸酒精分化和弱碱性溶液显蓝，如处理适宜，可使细胞核着清楚的深蓝色，胞浆等其它成分脱色。再利用胞浆染料伊红染胞浆，使胞浆的各种不同成分又呈现出深浅不同的粉红色。故各种组织或细胞成分与病变的一般形态结构特点均可显示出来。,.,7,HE染色结果,细胞核被苏木精染成鲜明的蓝色，软骨基质、钙盐颗粒呈深蓝色，粘液呈灰蓝色。细胞浆被伊红染成深浅不同的粉红色至桃红色，胞浆内嗜酸性颗粒呈反光强的鲜红色。胶原纤维呈淡粉红色，弹力纤维呈亮粉红色，红血球呈橘红色，蛋白性液体呈粉红色。着色情况与组织或细胞的种类有关，也随其生活周期及病理变化而改变。例如，很多细胞在新生时期胞浆对伊红着色较淡或轻度嗜碱，当其衰老时或发生退行性变则呈现嗜伊红浓染。胶原纤维在老化和出现透明变性时，伊红着色由浅变深。,.,8,二、HE染色试剂,1、Harris苏木素：称取苏木素精1g一氧化汞0.5g硫酸铝钾20g量取无水乙醇10ml蒸馏水200ml苏木素溶于无水乙醇，钾明矾溶于蒸馏水，二者混合后煮沸，离火，加入氧化汞，用玻棒搅拌，试剂变为深紫色，立即移入冷水快速冷却，静置一夜，过滤，棕色小磨口试剂瓶密封保存。使用前加入5%冰乙酸4ml（或冰乙酸3滴）。,.,9,HE染色试剂,2、0.5%伊红(水溶性)：称取伊红0.5g量取95%乙醇25ml蒸馏水75ml先取少量蒸馏水加入伊红，用玻棒将伊红碾碎并搅溶，再加入全部蒸馏水，完全溶解后，再加入乙醇，最后加入冰乙酸1滴。白色小磨口试剂瓶密封保存。,.,10,HE染色试剂,3、1%盐酸水溶液：盐酸3ml蒸馏水297ml混匀，白色试剂瓶保存。4、中性树胶封片往125ml棕色滴瓶中倒入中性树胶若干，加入二甲苯适量用吸管调匀，有一定粘稠度即可。试剂二甲苯1瓶Harris苏木素染液无水乙醇2瓶1%盐酸水溶液95%乙醇2瓶0.5%伊红(水溶性)染液中性树胶封片剂,.,11,5、伊红酒精液:伊红0.5克80%酒精100ml6、分化液:盐酸1ml加入70%酒精99ml即成。,.,12,三、HE染色步骤,整个染色过程包括五个内容：脱蜡,染色,脱水,透明和封固。(一)脱蜡:1.从温箱中取出烤干的切片,立即投入二甲苯中脱蜡510min(可在二瓶中进行),脱蜡时间长短取决于蜡是不彻底溶解。气温低可延长时间,气温高可适当缩短时间或在温箱中加速脱蜡。2.移入无水酒精(100%)(二瓶)中,约2min。3.移入90%酒精中(二瓶),约2min。4.移入80%酒精中(二瓶),约2min。5.移入70%酒精中,约2min。6.移入水中,洗去酒精,约23min。7.移入蒸馏水中,约2min。,.,13,HE染色步骤,常规脱蜡,苏木素染色（5-15min），水洗,盐酸乙醇溶液分化（30s），水洗,伊红染色（1-3min），水洗,氨水反蓝（30s），水洗,90%乙醇（5min）,80%乙醇（30s）,100%乙醇（2次10min）,二甲苯（3次5min）,封片,染色,脱水,透明,封片,脱蜡,染色的时间，应根据室温，及组织的具体情况来确定，做之前做预实验。,.,14,(二)染色:1.移入苏木素中,浸染815min,一般以稍深染为宜。2.移入水中,洗去苏木素和浮色,约12min。3.移入分化液(1%盐酸酒精)中,分化几秒至30秒钟,使切片褪色至淡兰红色即可。分化的作用,可使细胞浆兰色脱去,而细胞核更加清晰,鲜丽,分化不足时,胞浆带兰,胞核过染,分化过度时,胞核太淡,难以辩认,可再退回苏木素染液,延长一定时间。4.移入流水中,洗涤3060min,使组织呈鲜兰色或天兰色(兰化)。5.移入伊红液中,浸染25min,如着染缓慢,可在伊红液中加入冰醋酸(100ml伊红液加12滴冰醋酸)以助染。6.移入水中,洗去伊红浮液,并用纱布擦净玻片上的多余染料。,.,15,(三)脱水:1.吸去玻片上的水分后多入80%酒精中,(二瓶)脱水,约12min,如在酒精中褪色很快时,可迅速移入90%酒精或返回伊红液中复染。2.移入90%酒精中(二瓶)脱水,约24min。3.移入无水酒精(100%酒精)(二瓶)彻底脱水,约48min。(四)透明1.移入二甲苯中透明35min。2.移入二甲苯中透明510min。(五)封固:用树胶封固,先从二甲苯中取出切片,将组织外围的二甲苯迅速擦去,在滴上一滴树胶于组织片上,然后取干净的盖玻片,仔细加在封固剂上,慢慢压平,使盖片位置适中。切片封固后,放在温箱中烤干,或平置凉干后装盒。,.,16,四、HE染色注意事项,为使切片制作更符合质量标准或最佳。除按步骤严格进行外,还应注意以下几点:.用含升汞的固定液固定的组织块,在切片染色前,应进行脱汞,具体方法:切片脱蜡,逐次进入70%酒精后,入稀碘液(碘1克,碘化钾2克,蒸馏水3000ml)内510min。蒸馏水稍洗,入5%硫代硫酸钠溶液内5min。蒸馏水充分洗后进入染色。.组织块在45倍稀释的福尔马林液中固定过久,经常产生一种褐色素,叫福尔马林色素。这种色素不溶于水和酒精,但影响组织观察。以在脾、肝、肺发生充血、出血和渗血的组织中最常见,因此,切片在染色前经脱福尔马林色素的步骤。其方法:切片脱蜡,浸水后,投入伟勒卡依氏溶液(1%氢氧化钾液1ml,75酒精200ml)20分2h,充分水洗后染色。,.,17,HE染色注意事项,.如组织片含有大量黑色素时,影响染色和检查,可在脱蜡后,浸水后用0.25%高锰酸钾胶24h,然后,常水充分洗涤,或经1%草酸液脱去切片上的黄褐色后,再充分水洗,后进入染色。.在切片染色后,进行脱水时,当通过90%酒精后,应对切片进行仔细擦试,此时,把切片中组织片周围的污染涂色或水分用纱布(清洁)擦干净。当切片从100%酒精出来时,也要认真仔细擦去污物及组织片附近的水分。这样即可使组织脱水彻底,还可使酒精浓度不至明显降低尽量保持酒精原浓度。,.,18,注意事项,.封固时,可使灵活操作,一种方法是先在盖玻片上滴半滴树胶,再将载玻片从二甲苯中取出。擦去切片外围的二甲苯,翻转载玻片,使有组织的一面朝下,正好与盖玻片对准组织片,当盖玻片被粘附在载玻片下面时,翻转载玻片,压平盖玻片,并置于位置适中。另一种方法,将载玻片从二个苯中取出擦去外围的二甲苯后,立即在组织片上滴上半滴树胶。然后用小镊子挟取一盖玻片,翻转盖片并轻轻从酒精灯火焰上通过二次,再翻转过来,从载玻片上组织片一端轻轻放下,当盖片接触树胶时,可将盖片放下,树胶可自然扩散整个盖片,此时注意调整适当位置。如有气泡可轻轻压盖片从一侧挤出。注意树胶的量不宜过多,防止外溢,也不可过少,防止封闭不全。,.,19,五、HE染色技术几种常见的染色问题,1.染色：（1）苏木素染色A.苏木素染色太浅，细胞核与细胞质颜色对比度差。原因：染色时间短；苏木素过度氧化，失去染色能力；分化时间过长。对策：切片重新染色。,.,20,B.细胞核过染，核膜、核仁等不清晰，细胞质(尤其是皮肤上皮细胞)含有大量的细胞核染色液苏木精，导致细胞核与细胞质比例失调。原因：与图2相反，染色液时间过长、切片太厚、分化步骤时间太短。对策：如果切片不是因为太厚，脱色、漂白、重新染色，对于染色和分化时间做些适当的调整。若太厚则需要重新切片。,.,21,C.切片细胞核棕色，表明苏木精没有充分蓝化，或苏木精过度氧化失去染色能力原因：苏木精染色液过度氧化和切片在苏木精染液染色后返蓝不足。对策：染色前检查苏木精染色液的染色能力，过渡氧化，应及时更换。其次，在苏木精染色后，给切片以足够的蓝化时间。D.染色后有杂质原因：苏木精染色液中的金属膜，黏附在玻片上。对策：每天染色前仔细过滤苏木精染色液，或建议使用半氧化苏木精染色液。,.,22,2.脱蜡：切片中白色的区域脱蜡不彻底，染色液由于石蜡斑点的残留而不能渗透着色。原因：烤(烘)片温度太低，脱蜡前没有充分烤(烘)干。二甲苯脱蜡时间不足，或二甲苯使用过久，造成脱蜡不尽。对策：用无水乙醇去掉玻璃片上的水分，重新二甲苯脱去石蜡。切片需退回到脱蜡步骤，延长脱蜡时间，或跟换二甲苯，驼色、漂白、重新染色。,.,23,3.伊红着色A.切片中央区域伊红染色不均匀，可能为弱碱性溶液残留导致伊红拒染所致。原因：伊红染液的pH值可能大于5；也可能是蓝化液残留过多；切片太薄；或切片经伊红染色后在乙醇脱水时间过长。对策：检查伊红染液的pH值，用乙酸将其调节在4.6-5.0之间，使伊红染色色彩艳丽。确保每次蓝化后，用自来水冲干净。检查切片的厚度。脱水时不要让切片在低浓度乙醇停留时间过长，因为含水多的低浓度乙醇会将伊红的颜色分化掉。,.,24,B.伊红深染导致细胞核与细胞质没有层次，缺乏对比原因：伊红染色液浓度太高；切片在伊红染色时间过长；切片在伊红染色后经乙醇脱水步骤时过的太快，而使乙醇分化伊红的作用不能产生。对策：适当稀释伊红染色液，减少伊红染色时间，或者使切片在乙醇脱水等步骤时，停留时间相对均匀。同样，也要检查切片的厚度是否合适。,.,25,4.封片A.在显微镜下呈现大量水珠或云雾状改变原因：切片经梯度乙醇处理后没有完全脱水，导致二甲苯透明中性树胶封固后残留大量水分。也可能是封片的时候出现的气泡。对策：移去盖玻片，用二甲苯溶解封固剂如中性树胶。将切片置入新鲜的无水乙醇换几道。待切片重新脱水完全后，用新二甲苯透明，中性树胶封固。所有用于脱水和透明的液体，在使用一定时间以后，应即时更换。将切片浸如二甲苯中，重新封片。,.,26,