无菌操作技术原理及实验PPT课件

1、无菌操作技术的原理和实验、2、无菌操作技术、定义：在实验作业中，控制或防止各种微生物污染及其干扰的一系列操作方法和相关措施。 目的：保证培养物不受环境中微生物污染，防止受检微生物在操作过程中污染环境或感染操作者。 范围：微生物无菌操作技术细胞无菌培养。3、微生物无菌操作技术和接种技术、原理：无菌技术：在微生物实验工作中，控制或防止各种微生物污染及其干扰的一系列操作方法和相关措施。 接种：将微生物接收到适合繁殖的人工培养基或活体内的过程。 4、1 .接种针2 .接种环3 .接种钩4.5 .玻璃涂层棒6 .接种环7 .接种锹8 .小解剖刀、无菌操作材料：接种具、无菌器材准备：灭菌器材：对枪口、玻璃器材、培养基、无菌衣物等进行高压灭菌处理。5、培养基的制备：目的菌：大肠杆菌LB培养基：(胨容易吸湿，必须迅速称重的某种药品取出后，洗净药匙擦拭后称另一种药品。 ) pH:7.4-7.6； (请勿过度调整，以免因召回而影响各离子浓度。 (分装要求：(分装时，不要在瓶口附着培养基，不要弄脏瓶塞。 液体：试管：试管高度的1/4三角瓶：容积的1/2以下固体：试管：1/5以下，灭菌后制成斜面的平盘： 15ml。 灭菌条件： 121，20min。 (温度时间过长不要破坏营养物质)添加抗生素： 50，握住3s不要烫伤手。 无菌检查：将灭菌培养基放入37培养24-48h进行观察。6、灭菌方式：放射线灭菌： 60Co-射线、医疗器械、容器、生产辅助用品、不破坏放射线的原料药和产品等。 干热灭菌法：利用干热空气杀死微生物，除去热原物质的方法。 160170*120min以上、170180*60min以上或250*45min。 适用于耐高温但不应用湿热灭菌法灭菌的物品的灭菌。 例如玻璃器具、金属材质容器、纤维制品、固体试剂、液状石蜡等可以用本方法灭菌. 湿热灭菌法：热灭菌中最有效，应用最广。 121，30min。 药品、容器、培养基、无菌服、橡胶塞等在高温和湿气下没有变化或破损的物品可以用本方法灭菌。 气体灭菌法：环氧乙烷、气态过氧化氢、甲醛、臭氧(O3)等。 过滤除菌法：除菌过滤器分为亲水和疏水，孔径通常在0.22um以下。 过滤器对过滤的成分不能有吸附作用，不能释放物质，纤维不能脱落。 紫外线灭菌： UVC200-300nm、254-257nm灭菌能力最强。 原理：胸腺嘧啶二聚体的形成和诱导DNA链交联，产生抑制DNA复制的臭氧进行共同杀菌。7、高压灭菌锅的操作步骤和注意事项：仪器检查：仪器放在水平的地面上，周围有缝隙。 加水：水位到平台，不要太高。 使用去离子水。 配置：相互有适当的间隙，有利于蒸汽渗透，提高灭菌效果。 密封：顺时针旋转直到不旋转。 加热：打开开关，检查温度和时间。 排气：打开气阀，冷空气就被排出。 灭菌：排出干燥的冷空气后，关闭阀门。 结束：关闭开关，压力为0，打开排气阀排气，然后打开高压釜。 注意：高压装有液体的瓶子要放松瓶盖，瓶子内的压力过大，瓶子不要破裂。包装报纸的东西要立即进行干燥处理。 8、抗生素的制备和保存：用适当的溶剂溶解后，用0.22um过滤除菌。 氨苄青霉素：-20长期保存，4保存1个月，37保存23天。 卡那霉素、四环素、链霉素：-20长期保存，4、37略长于氨苄青霉素保存时间，四环素遮光保存。 9、无菌环境的要求和保持：无菌环境、无菌室超清洁工作台(原理：在特定的空间内，清洁空气(过滤空气)向设定的方向流动而形成。使用前点亮紫外线灯照射4060分钟，接通超清洁工作台的电源，熄灭紫外线灯，用75%酒精或0.5%过氧乙酸喷雾器擦拭消毒工作台。 使用过程中，有机玻璃罩被污染，请勿用酒精棉球擦拭。 请用含水棉布刷子擦拭清洁台，干燥，不要堆积垃圾使用完毕后，关闭气体开关或酒精灯使用后，用消毒液擦拭桌面，切断电源，重新照射紫外线灯15分钟。 定期卸下初期过滤器进行清洗，清洗周期通常为36个月的高效空气过滤器的使用期限为18个月。 定期进行无菌试验，测定洁净工作台是否满足无菌要求。超洁净台的使用与维护、10、无菌操作要求： (1)使用操作中不得大幅度或迅速动作的(2)玻璃制器具时，请轻轻放置。 (3)在火焰上操作，水平距离5cm范围内为无菌区域。 (4)接种器具在使用前和使用后均须烧灼灭菌(5)接种培养物时，动作应轻、准确。 (6)不得用喷嘴直接吸管。 (7)带菌液的吸管、玻璃板等器材应立即放入装有5%溶胶溶液的消毒罐内消毒。 (8)使用酒精灯时，酒精量不得小于其容积的2/3，也不得小于其容积的1/3。11、接种技术：常用接种方法：斜面接种线接种液体接种穿刺接种、接种的基本步骤：12、斜面接种：从生长的菌种斜面提取少量菌种并移植到另一新鲜的斜面培养基中的接种方法。 用于好氧微生物接种。 记号：接种前在试管上打开菌名、接种日、接种者名的酒精灯。 接种工序：13，从斜面菌接种到液体培养基(试管和三角瓶等)的方法。 意义：质粒扩增，蛋白质大量表达。 操作方法：与斜面法基本一致，将接种环送入液体培养基时，使环在液体与管壁接触处轻微摩擦，分散菌体，塞棉塞轻轻摇动。 菌种在液体培养基培养时，一般用移液管或吸管接种，液体接种，14，划线接种和平板涂布，使混合的细菌分别分散生长，形成单一菌落，得到纯菌活菌数。 方法：分区划线法：适用于含菌量多的标本连续划线法：适用于含菌量少的标本，分区划线法，连续划线法，15，注意：倒置平板(防止碟盖水滴落入菌落)。 重力使营养下沉，为菌体提供营养”。 在平盘的底部显示名称、日期、样品名称，以免平盘多时弄错盘盖搅乱样品。 16、用接种针从菌种斜面采集少量菌体，穿刺固体或半固体深层培养基的接种方法。 用于厌氧细菌培养、细菌运动能力检测、菌种保存。 只适合细菌和酵母的接种培养，穿刺接种、接种工序： (1)试管(2)拿着松棉栓(3)接种针进行烧灼灭菌，穿刺中可能进入试管的其他部位也进行烧灼灭菌，(4)拔出棉栓(5)取菌：用冷却接种针的针尖附着少量菌种(6)进行穿刺：将接种针从培养基的中心顺利地， 迅速垂直刺入培养基，接近试管底部后，沿接种线拔出(7)插头棉塞(8)接种针进行烧灭菌，17，细胞培养，维持和维持细胞室无菌环境：进入细胞室前，在缓冲之间更换实验服，每天早上更换拖鞋清理细胞，照射紫外光30分钟。 培养箱的使用和维护：定期的每个灭菌场所配置细胞瓶，不要对着容易找的开放培养箱说话，以免长时间打开培养箱，从培养箱中取出防止污染的细胞时，要拧紧瓶盖。 将细胞放入培育箱时，70%的酒精会擦拭瓶口在超纯台内处理细胞时，防止操作者的手或什么东西通过细胞瓶口，在酒精灯附近严格操作。18、1 .无菌操作的定义和目的是什么？2 .配制培养基的过程中应该注意的问题是什么？ 为什么3 .如何检查灭菌培养基是否无菌