第三章_酶(2012.09)

第三章酶,Enzyme,一般概述,酶是一类由活细胞产生的，对其特异底物具有高效催化作用的蛋白质和核酸，前者是机体内催化各种代谢反应最主要的催化剂。核酶（ribozyme）：具有高效、特异催化作用的核酸（RNA）。主要参与RNA的剪接。酶催化的生物化学反应，称为酶促反应。在酶的催化下发生化学变化的物质，称为底物。,第一节酶的分子结构与功能,一、分子组成,1、酶的分类,单体酶：只有一条多肽链,寡聚酶：具有多条多肽链多酶体系：在细胞内存在着许多由几种不同功能的酶彼此聚合形成的多酶复合物。如：丙酮酸脱氢酶体系。,多功能酶（串联酶）：一个酶分子具有多种生物催化活性，由多酶体系在进化中基因融合形成,酶蛋白(apoenzyme)：多肽；决定特异性、高效性,辅助因子(cofactor)：非蛋白组分；递氢、电子、基团；决定反应类型、性质,全酶(holoenzyme),结合酶（conjugatedenzyme）：,单纯酶（simpleenzyme）：仅由氨基酸残基构成的酶。如：淀粉酶、脲酶、脂酶、一些消化蛋白酶、核糖核酸酶等。,二、活性中心(activesite),必需基团：与酶活性密切相关的基团。包括活性中心的必需基团、活性中心以外的必需基团。,活性中心：底物结合部位催化部位,活性中心是酶的必需基团在空间结构上彼此靠近，组成具有特定空间结构、能与底物特异地结合并将底物转化为产物，这一区域称为酶的活性中心或活性部位。,三、同工酶,定义：同工酶(isoenzyme)是指催化相同的化学反应，而酶蛋白的分子结构、理化性质乃至免疫学性质不同的一组酶。,举例：乳酸脱氢酶(LDH1LDH5),生理及临床意义在代谢调节上起着重要的作用；用于解释发育过程中阶段特有的代谢特征；同工酶谱的改变有助于对疾病的诊断；同工酶可以作为遗传标志，用于遗传分析研究。,1,2,3,4,5,酶活性,迁移位置,酶活性,迁移位置,a,b,(a)LDH同工酶电泳图谱(b)（a）正常人LDH同工酶电泳图谱,（b）心肌梗塞病人血清LDH同工酶电泳图谱,1,2,3,4,5,第二节酶的工作原理,酶与一般催化剂的共同点在反应前后没有质和量的变化；只能催化热力学允许的化学反应；只能加速可逆反应的进程，而不改变反应的平衡点。,酶与一般催化剂催化效率的比较,底物催化剂反应温度反应速度常数尿素H+627.410-7脲酶215.0106过氧化氢Fe2+2256过氧化氢酶223.5107,酶反应具有极高的效率,与不加催化剂相比提高1081020，与普通催化剂相比提高1071013,（一）酶促反应具有极高的效率,一、酶促反应的特点,酶的催化效率通常比非催化反应高1081020倍，比一般催化剂高1071013倍。酶的催化不需要较高的反应温度。酶和一般催化剂加速反应的机理都是降低反应的活化能(activationenergy)。酶比一般催化剂更有效地降低反应的活化能。,活化能：底物分子从初态转变到活化态所需的能量。,（1）绝对特异性：一种酶只作用于一种底物,发生特定反应，生成一种产物。如：,（二）酶促反应具有高度特异性,（2）相对特异性：作用于一类化合物或一种化学键。如脂肪酶、磷酸酶和蛋白水解酶等。包括键专一性和基团专一性,（3）立体异构特异性：只能催化一种立体异构体进行反应。如：L-乳酸脱氢酶：作用于L-乳酸延胡索酸酶：作用于反式的丁烯二酸,组HO,CH3,COOH,组,HOOC,CH3,OH,L（-）乳酸D（+）乳酸（与LDH契合）（不能在LDH中的三点结合）,精,精,L-乳酸脱氢酶的催化作用特异性,（三）酶促反应具有可调节性,对酶生成与降解量的调节酶催化效力的调节通过改变底物浓度对酶进行调节等,酶促反应受多种因素的调控，以适应机体对不断变化的内外环境和生命活动的需要。其中包括三方面的调节。,过渡态,起始态,终态,能量,反应过程,化学反应速率的依赖因素：分子间碰撞频率；有效碰撞分子的百分数。,能阈:反应物分子发生化学变化所需最低能量活化分子:含有高于反应能阈而能起反应的分子活化能:活化分子具有的高于平均水平的能量,供给能量，如加温、光照等降低活化能,加快反应速度的方法：,几个概念：,酶作用高效率的机制,中间产物学说在酶催化的反应中，第一步是酶与底物形成酶底物中间复合物。当底物分子在酶作用下发生化学变化后，分解成产物和酶。E+S=E-SP+E许多实验事实证明了ES复合物的存在。ES复合物形成的速率与酶和底物的性质有关。,一般催化剂反应活化能,反应总能量变化,酶促反应活化能,非催化反应活化能,初态,终态,能量改变,活化过程,酶促反应降低活化能,过渡态,1、酶-底物结合方式：诱导契合,2、邻近效应和定向效应,在酶促反应中，底物分子结合到酶的活性中心，一方面底物在酶活性中心的有效浓度大大增加，有利于提高反应速度；另一方面，由于活性中心的立体结构和相关基团的诱导和定向作用，使底物分子中参与反应的基团相互接近，并被严格定向定位，使酶促反应具有高效率和专一性特点。,举例,咪唑和对-硝基苯酚乙酸酯的反应是一个双分子氨解反应.,实验结果表明，分子内咪唑基参与的氨解反应速度比相应的分子间反应速度大24倍。说明咪唑基与酯基的相对位置对水解反应速度具有很大的影响。,举例,3、表面效应(surfaceeffect)：疏水“口袋”,疏水口袋,肽链,底物,4、多元催化作用,酶的活性中心部位，一般都含有多个起催化作用的基团，这些基团在空间有特殊的排列和取向，可以对底物价键的形变和极化及调整底物基团的位置等起到协同作用，从而使底物达到最佳反应状态。,(1)酸碱催化,酸-碱催化可分为狭义的酸-碱催化和广义的酸-碱催化。酶参与的酸-碱催化反应一般都是广义的酸碱催化方式。广义酸碱催化是指通过质子酸提供部分质子,或是通过质子碱接受部分质子的作用，达到降低反应活化能的过程。,酶催化反应机制类型,广义酸基团广义碱基团（质子供体）（质子受体）,酶分子中可以作为广义酸、碱的基团：,His是酶的酸碱催化作用中最活泼的一个催化功能团。,(2)共价催化,催化剂通过与底物形成反应活性很高的共价过渡产物，使反应活化能降低，从而提高反应速度的过程，称为共价催化。酶中参与共价催化的基团主要包括His的咪唑基，Cys的硫基，Asp的羧基，Ser的羟基等。某些辅酶，如焦磷酸硫胺素和磷酸吡哆醛等也可以参与共价催化作用。,(3)亲核催化作用,酶活性中心有的基团属于亲核基团，可以提供电子给带有部分正电荷的过渡态中间物，从而加速产物的生成。此种催化机制称为亲核催化作用。,第三节酶促反应动力学,底物浓度的影响酶浓度的影响温度、pH的影响抑制剂、激活剂的影响,单底物、单产物反应；酶促反应速率一般在规定的反应条件下，用单位时间内底物的消耗量和产物的生成量来表示；反应速率取其初速率，即底物的消耗量很小（一般在5以内）时的反应速率底物浓度远远大于酶浓度。,研究前提：,一、底物浓度对反应速率影响的作图呈矩形双曲线,在低底物浓度时,反应速度与底物浓度成正比，表现为一级反应特征。当底物浓度达到一定值，几乎所有的酶都与底物结合后，反应速度达到最大值（Vmax），此时再增加底物浓度，反应速度不再增加，表现为零级反应。,在其他因素不变的情况下，底物浓度对反应速度的影响呈矩形双曲线关系。,当底物浓度较低时：,反应速率与底物浓度成正比；反应为一级反应。,随着底物浓度的增高：,反应速率不再成正比例加速；反应为混合级反应。,当底物浓度高达一定程度：,反应速率不再增加，达最大速率；反应为零级反应,中间产物,解释酶促反应中底物浓度和反应速率关系的最合理学说是中间产物学说：,（一）米曼氏方程式揭示单底物反应的动力学特性,1913年Michaelis和Menten提出反应速率与底物浓度关系的数学方程式，即米曼氏方程式，简称米氏方程式(Michaelisequation)。,S：底物浓度V：不同S时的反应速率Vmax：最大反应速率(maximumvelocity)m：米氏常数(Michaelisconstant),1.E与S形成ES复合物的反应是快速平衡反应，而ES分解为E及P的反应为慢反应，反应速率取决于慢反应即V=k3ES。(1)2.S的总浓度远远大于E的总浓度，因此在反应的初始阶段，S的浓度可认为不变即S=St。,米曼氏方程式推导基于两个假设：,米曼氏方程式推导过程：,ES的生成速率=ES的分解速率,则(2)变为:(EtES)S=KmES,整理得：,k1(EtES)S=k2ES+k3ES,当反应处于稳态时：,当底物浓度很高，将酶的活性中心全部饱和时，即Et=ES，反应达最大速率Vmax=k3ES=k3Et(5),将(5)代入(4)得米氏方程式：,（二）Km与Vm是有意义的酶促反应动力学参数,Km值的推导Km与Vmax的意义,当反应速率为最大反应速率一半时：,Km值的推导,Km=S,Km值等于酶促反应速率为最大反应速率一半时的底物浓度，单位是mol/L。,km=（k2+k3)/k1,Kmk2/k1,km可以看作ES的解离常数ks：,当km大，说明ES容易解离，酶与底物结合的亲和力小。,k1,k2,k3,Km与Vmax的意义,定义：Km等于酶促反应速率为最大反应速率一半时的底物浓度。意义：Km是酶的特征性常数之一，只与酶的结构、底物和反应环境（如，温度、pH、离子强度）有关，与酶的浓度无关。Km可近似表示酶对底物的亲和力；同一酶对于不同底物有不同的Km值。,Km值,Vmax,意义：Vmax=k3E,定义：Vm是酶完全被底物饱和时的反应速率，与酶浓度成正比。,如果酶的总浓度已知，可从Vmax计算酶的转换数(turnovernumber)，即动力学常数k3。,定义:当酶被底物充分饱和时，单位时间内每个酶分子催化底物转变为产物的分子数。意义:可用来比较每单位酶的催化能力。,酶的转换数(turnovernumber),1.双倒数作图法(doublereciprocalplot)，又称为林-贝氏(Lineweaver-Burk)作图法,（三）m值与max值可以通过作图法求取,2.Hanes作图法,在林贝氏方程基础上，两边同乘S,S/V=Km/Vmax+S/Vmax,二、酶浓度的影响：正比,三、温度影响：最适温度,四、pH值影响：最适pH,五、抑制剂影响,竞争性抑制：丙二酸；磺胺药，等,1、不可逆抑制剂,2、可逆抑制剂,非竞争性抑制,反竞争性抑制,六、激活剂的影响,第四节酶的调节,调节对象：关键酶,（一）别构酶（变构酶）与变构调节,变构效应剂(allostericeffector),变构调节(allostericregulation),变构酶(allostericenzyme),变构部位(allostericsite),一些代谢物可与某些酶分子活性中心外的某部分可逆地结合，使酶构象改变，从而改变酶的催化活性，此种调节方式称变构调节。,一、调节酶实现对酶促反应速率快速调节,v,S,变构酶的S形曲线,变构抑制,变构激活,变构酶,米氏酶,变构激活,ATP、柠檬酸,（）,AMP、ADP2,6-二磷酸果糖1,6-二磷酸果糖,(+),6-磷酸果糖激酶-1的变构调节,蛋白激酶A(无活性),蛋白激酶A(有活性),cAMP,C,C,C,C,R,R,R,R,蛋白激酶A的激活,（二）酶的共价修饰调节,共价修饰(covalentmodification)在其他酶的催化作用下，某些酶蛋白肽链上的一些基团可与某种化学基团发生可逆的共价结合，从而改变酶的活性，此过程称为共价修饰。,常见类型磷酸化与脱磷酸化（最常见）乙酰化和脱乙酰化甲基化和脱甲基化腺苷化和脱腺苷化SH与SS互变,酶的磷酸化与脱磷酸化,三、酶原和酶原的激活,酶原(zymogen)：酶的无活性的前体酶原的激活：由无活性的酶原转变为有活性的酶的过程。酶原激活的意义：在特定的环境和条件下发挥作用；避免细胞自身消化；有的酶原可以视为酶的储存形式。,酶原激活的机理:,二、酶含量的调节包括对酶合成与分解速率的调节,诱导作用(induction)阻遏作用(repression),（一）酶蛋白合成可被诱导或阻遏,溶酶体蛋白酶降解途径（不依赖ATP的降解途径）非溶酶体蛋白酶降解途径（又称依赖ATP和泛素的降解途径）,（二）酶降解的调控与一般蛋白质降解途径相同,第五节酶的分类与命名,酶的分类及命名,一.酶的分类,1961年国际酶学委员会（EnzymeCommittee,EC）根据酶所催化的反应类型和机理，把酶分成6大类：,一、酶的分类,1、氧化还原酶（oxidoreductase）2、转移酶（transferase）3、水解酶（hydrolase）4、裂解酶（或裂合酶lyase）5、异构酶（isomerase）6、合成酶（synthease）或连接酶（ligase）,氧化-还原酶催化氧化-还原反应，催化氢的转移或电子传递。主要包括脱氢酶(dehydrogenase)和氧化酶(Oxidase)。如，乳酸(Lactate)脱氢酶催化乳酸的脱氢反应。,1、氧化-还原酶Oxidoreductase,（1）脱氢酶类：催化直接从底物上脱氢的反应,（2）氧化酶类,催化底物脱氢，氧化生成H2O2：,催化底物脱氢，氧化生成H2O：,（3）过氧化物酶,（4）加氧酶（双加氧酶和单加氧酶）,转移酶催化基团转移反应，即将一个底物分子的基团或原子转移到另一个底物的分子上。根据X分类：转移碳基、酮基或醛基、酰基、糖基、烃基、含氮基、含磷基和含硫基的酶。例如，谷丙转氨酶催化的氨基转移反应。,2、转移酶Transferase,水解酶催化底物的加水分解反应。主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。例如，脂肪酶(Lipase)催化的脂的水解反应：,3、水解酶hydrolase,裂合酶催化从底物分子中移去一个基团或原子形成双键的反应及其逆反应。主要包括醛缩酶、水化酶及脱氨酶等。例如，延胡索酸水合酶催化的反应。,4、裂合酶Lyase,异构酶催化各种同分异构体的相互转化，即底物分子内基团或原子的重排过程。例如，6-磷酸葡萄糖异构酶催化的反应,5、异构酶Isomerase,合成酶，又称为连接酶，能够催化C-C、C-O、C-N以及C-S键的形成反应。这类反应必须与ATP分解反应相互偶联。例如，丙酮酸羧化酶催化的反应。丙酮酸+CO2草酰乙酸,6、合成酶LigaseorSynthetase,二、酶的命名习惯命名：由发现者命名，常以底物名、反应性质以及酶的来源命名；系统命名（1961年国际酶学委员会确定）每一个酶由下列三种表示：1、系统名称：底物名+反应性质2、分类编号：E.C.+四个数字3、推荐名：选一个习惯名（实用、简单）,系统名：包括所有底物的名称和反应类型。,惯用名：只取较重要的底物名称和反应类型。,对于催化水解反应的酶一般在酶的名称上省去反应类型。,第六节酶与医学的关系,一、酶与疾病的发生：酶的数量、结构、位置及其调节改变,2、酶与疾病的诊断：血清酶活性测定,3、酶与疾病的治疗替代治疗：消化不良-胃酶、胰酶抗菌治疗：磺胺药对症治疗：预防血栓形成-尿激酶、链激酶、纤溶酶抗癌治疗：MTXFH2还原酶,二、酶在医学上的其他应用,1、酶作为试剂用于临床检验和科学研究,（1）酶法分析：即酶偶联测定法(enzymecoupledassays)，是利用酶作为分析试剂，对一些酶的活性、底物浓度、激活剂、抑制剂等进行定量分析的一种方法。,（2）酶标记测定法：酶可以代替同位素与某些物质相结合，从而使该物质被酶所标记。通过测定酶的活性来判断被标记物质或与其定量结合的物质的存在和含量。,（3）工具酶：除上述酶偶联测定法外，人们利用酶具有高度特异性的特点，将酶做为工具，在分子水平上对某些生物大分子进行定向的分割与连接。,2、酶作为药物用于临床治疗,3、酶的分子工程,（1）固定化酶(immobilizedenzyme),将水溶性酶经物理或化学方法处理后，成为不溶于水但仍具有酶活性的一种酶的衍生物。固定化酶在催化反应中以固相状态作用于底物，并保持酶的活性。,（2）抗体酶(abzyme),（3）模拟酶,具有催化功能的抗体分子称为抗体酶,模拟酶是根据酶的作用原理，利用有机化学合成方法，人工合成的具有底物结合部位和催化部位的非蛋白质有机化合物。,结合酶的分子组成,酶蛋白决定反应的特异性辅助因子决定反应的种类与性质,辅助因子最为多见的是金属离子。含金属离子的酶分为：金属酶：金属离子与酶结合紧密,提取的过程中不易丢失,这类酶称为金属酶。如羧基肽酶、黄嘌呤氧化酶等。金属激活酶：金属离子虽为酶的活性所必需，却不与酶直接结合，而是通过底物相连接。这类酶称为金属激活酶。如己糖激酶等。,金属离子在全酶中的作用,传电子：作为酶活性中心的催化基团参与催化反应、传递电子。架桥梁：作为连接酶与底物的桥梁，便于酶对底物起作用。稳构象：稳定酶的构象所必需。降斥力：中和阴离子，降低反应中的静电斥力。,小分子有机化合物是一些化学稳定的小分子物质，称为辅酶。辅基：与酶蛋白共价结合，结合紧密，不能通过透析或超滤将其除去，在反应中辅基不能离开酶蛋白。如金属离子多为此，FAD、FMN、生物素等。,小分子有机化合物在催化中的作用,酶的结构,1结合部位Bindingsite酶分子中与底物结合的部位或区域一般称为结合部位。,（一）酶分子的结构特点,酶分子中促使底物发生化学变化的部位称为催化部位通常将酶的结合部位和催化部位总称为酶的活性部位或活性中心结合部位决定酶的专一性催化部位决定酶所催化反应的性质,2催化部位（catalyticsite）,必需基团：酶表现活性不可缺少的基团,活性中心内的必需基团：结合、催化。活性中心外的必需基团：维持酶活性中心应有的空间构象和（或）作为调节剂的结合部位所必需。,活性中心的常见基团：His的咪唑基，Ser的羟基，Cys的巯基，Glu的羧基,底物,活性中心以外的必需基团,结合基团,催化基团,活性中心,二、酶浓度对反应速度的影响,当SE，反应速度与酶浓度成正比。关系式为：V=K3E,三、温度的影响,温度升高,酶促反应速度加快。温度升高,酶的高级结构将发生变化或变性，导致酶活性降低甚至丧失。大多数酶都有一个最适温度。在最适温度条件下,反应速度最大。,最适温度(optimumtemperature)：酶促反应速度最快时的环境温度。它不是酶的特征性常数,四、pH的影响,最适pH：酶具有最大的催化活性时的环境pH值。它不是酶的特征性常数,五、抑制剂对酶活性的影响,使酶的活性降低或丧失、但不使酶蛋白变性的的现象，称为酶的抑制作用。能够引起酶的抑制作用的化合物则称为抑制剂。酶的抑制剂一般能够与酶以非共价或共价的方式形成比较稳定的复合体或结合物。与酶变性的区别：抑制剂对酶有一定的选择性，而变性剂对酶没有选择性,有机磷化合物羟基酶解毒-解磷定(PAM)重金属离子及砷化合物巯基酶解毒-二巯基丙醇(BAL),概念,举例,抑制剂通常以共价键与酶活性中心的必需基团相结合，使酶失活。,（一）不可逆性抑制剂主要与酶共价结合,羟基酶:以丝氨酸侧链上的羟基为必需基团的酶有机磷(敌百虫、敌敌畏、对硫磷)不可逆抑制羟基酶的活性中心,解毒-解磷定(PAM)：,路易士气,失活的酶,巯基酶,失活的酶,酸,BA