DNA损伤突变和修复.ppt

1,基因突变（genemutation）:在生物进化过程中，由于生物体内外环境多种因素的影响，使遗传物质的结构改变而引起遗传信息的改变，均可称为突变。从分子水平来看，突变主要表现为DNA分子上碱基的改变。,P68,2,各种体内外因素所导致的DNA组成与结构的变化称为DNA损伤（DNAdamage）,(1)DNA的结构发生永久性改变，即突变(2)导致DNA失去作为复制和/或转录的模板的功能，使细胞的功能出现障碍，重则死亡。,DNA损伤的后果:,3,受损细胞的转归，很大程度上取决于DNA的修复效果：（1）正确有效的修复（2）损伤严重，不能被有效修复（3）不完全修复,4,突变的意义,（一）突变是进化、分化的分子基础。（二）只有基因型改变的突变形成DNA的多态性这种突变没有可察觉的表型改变，如兼并密码子第三位碱基的改变、蛋白质非功能区段上编码序列的改变等。多态性用于描述个体之间的基因型差别现象。（三）致死性的突变可导致个体、细胞的死亡（利用此特性消灭有害病原体）。（四）突变是某些疾病的发病基础。,P69,5,第一节多种因素可引起DNA损伤并具有各自的机制,6,一、引起DNA损伤的因素,自发突变：频率：10-9,诱变因素,病毒等,P70,7,（一）DNA的自发性损伤,P70,1、DNA的复制错误,8,嘌呤碱(purinebases),O,鸟嘌呤,(2-氨基，6-氧嘌呤),9,O,嘧啶碱（pyrimidinebases）,尿嘧啶（U）,O,CH3,胸腺嘧啶（T）,NH2,O,C,C,N,CH,CH,N,H,胞嘧啶（C）,（2-氧,4-氨基嘧啶）,（2,4-二氧嘧啶）,（5-甲基尿嘧啶）,10,11,脱氨基,12,（二）环境造成的DNA损伤,P70,1、紫外线引起的DNA损伤,胸腺嘧啶二聚体DNA之间交联DNA与蛋白质交联DNA链断裂,13,2、电离辐射引起DNA损伤,14,3、烷化剂引起DNA损伤,15,R|,+,R|,+,-,烷基化鸟嘌呤m7G,鸟嘌呤G,鸟嘌呤*G*,（1）电荷平衡N1脱氢,1,2,3,4,5,6,7,8,9,烷基化,例：当“G”的N7-位烷基化N+7-R，会出现两种情况：（1）电荷平衡，N1脱氢；,16,G*少了一个氢键条件，,G*不能与C配对，改为与T配对。导致基因转换型突变。,G*T,5G3C,G烷基化N1脱氢,17,（2）G烷基化后，糖苷键断裂,出现脱嘌呤现象。插入碱基修复时，有1/4的可能性恢复正常，有3/4的可能性变异。,1.GG正常,2.GA3.GT4.GC,变异了,R,18,损伤,交连,这种“X”型的交连，导致染色体畸变，细胞容易死亡。,两条双链DNA,19,4、碱基类似物、修饰剂引起碱基对的改变,（1）碱基类似物用作促突变剂或抗癌药物,5-氟尿嘧啶（5-FU）、5-溴尿嘧啶（5-BU）、2-氨基腺嘌呤（2-AP）。,（2）某些化学物质能专一修饰DNA链上碱基,亚硝酸盐：使C脱氨变成U，经复制使G-CA-TA脱氨基变成I，I与C配对，结果A-TG-C黄曲霉素B：专一攻击DNA上碱基，导致序列变化,这些均为诱发突变的化学诱变剂或致癌剂,20,黄曲霉素是致肝癌的重要危险因子黄曲霉素B1经CYP作用生成的黄曲霉素2,3-环氧化物可与DNA分子中鸟嘌呤结合，引起DNA突变。,黄曲霉素B1,2,3-环氧黄曲霉素,DNA-鸟嘌呤,环曲霉素与DNA的结合产物,谷胱甘肽结合产物,21,二、DNA损伤的类型,单点突变、多点突变转换、颠换,链内共价交联链间共价交联,电离辐射、某些化学试剂使链内磷酸二酯键断裂,单个碱基、多个碱基、一段序列的插入或缺失,DNA分子内发生较大片段的交换。,P69,22,一个碱基的变异。有转换同型碱基和颠换异型碱基。转换:一种嘌呤换成另一种嘌呤或一种嘧啶换成另一种嘧啶。颠换:嘌呤换成嘧啶或嘧啶换成嘌呤。,点突变,点突变pointmutation（错配mismatch）,P69,23,GTG,正常成人HbA基因,GAG,CTC,镰刀形红细胞性贫血患者HbS与正常成人HbA比较,24,HbS的红细胞正常人红细胞,HbS与HbA红细胞形态,25,插入：一个碱基或一段核苷酸插入到DNA大分子中缺失：一个碱基或一段核苷酸从DNA上消失框移突变：由于缺失和插入，使三联体密码的阅读方式改变。但3个或3n个核苷酸插入或缺失不一定引起框移突变(frame-shiftmutation)。,5.UCACGACAUAUG.3,丝,精,组,蛋,5.UCAGACAUAUG.3,丝,天冬,异亮,缺失,mRNA,插入(insertion)、缺失(deletion)和框移突变,P69,26,由基因重排引起的两种地中海贫血基因型,DNA分子内发生较大片段的交换，也称为重组。,重排（rearrangement）,P69,27,由基因重排引起的两种地中海贫血基因型,28,第二节DNA损伤修复机制是遗传保守性的重要保障,29,DNA修复（DNArepair）是指纠正DNA两条单链间错配的碱基、清除DNA链上受损的碱基或糖基、恢复DNA的正常结构的过程。DNA修复是机体维持DNA结构的完整性与稳定性，保证生命延续和物种稳定的重要环节。,30,正常修复功能,修复功能缺陷,31,DNA修复的特定通路,32,人类DNA修复通路,修复类型基因种类损伤种类,单碱基剪切修复DNAligase(LIG3),单碱基损伤DNAglycosylase(MBD4,MPG,MYH,NTH1,OGG1,SMUG1,TDG,UNG),APE1,APE2,XRCC1,ADPRT,ADPRTL2,ADPRTL3.,多碱基剪切修复XPA,XPC,XPE,XPF/ERCC4,多碱基损伤XPG/ERCC5,ERCC1,LIG1,（紫外线、吸烟）CSB/ERCC6,CSA/CKN1,XAB2,TFIIH(XPB/ERCC3XPD/ERCC2,GTF2H1,GTF2H21,GTF2H3,GTF2H4,CDK7,CCNH,MNAT),DDB1,DDB2,MMS19,CENN2,AD23A,RAD23B,RPA1,RPA2,RPA3.,碱基错配修复MSH2,MHS3,MSH6,MSH4,碱基错配MSH5,MLH1,MLH3,PMS1,PMS2,PMS2L3,PMS2L4.,Woodetal,Science,2001,重组修复RAD50,RAD51,RAD51B,RAD51C,DNA双链断裂RAD51D,RAD54L,RAD54B,V(D)J重组RAD52,DMC1,MRE11A,NBS1,ERCC1,XPF/ERCC4,XRCC2XRCC3,XRCC4,XRCC5,XRCC6XRCC7,XRCC8,BRCA1,BRCA2.,33,DNA损伤修复：对已发生分子改变的DNA进行补偿措施，使其回复为原有的天然状态。,DNA损伤修复的主要机制,（一）光修复（二）切除修复（三）重组修复（四）SOS修复,34,一、某些DNA损伤可以直接修复,1、二聚体可被光复活酶直接修复（光修复）,UV,紫外线照射可引起核酸链上相邻的两个胸腺嘧啶形成二聚体TT。光修复过程是通过光复活酶催化而完成的，需300600nm波长照射激活。,嘧啶二聚体的形成与解聚,P71,35,2、DNA断裂口可以直接修复,在5-P端和3-OH端未受损伤情况下，连接酶能直接修复因电离辐射等因素造成的DNA断裂口。,3、烷基化碱基可以直接修复,大肠杆菌中有一种Ada酶，能将烷基不可逆地转移到自身，从而修复甲基化碱基和甲基化的磷酸二酯键，同时其自身失活。,36,二、切除修复(excisionrepair)是常见的修复方式,定义在有关酶和蛋白质的作用下，去除DNA链的损伤部分，用执行修复功能的DNA聚合酶催化dNTP聚合而填补缺口，最后用连接酶将修复过的链与无损伤的链两端连接起来。是细胞内最重要和有效的修复机制，主要由DNA-pol和连接酶完成。,P71,37,1、单个核苷酸的切除修复,特定的DNA糖苷酶识别并切除受损碱基AP核酸内切酶识别裸露脱氧核糖上的AP位点（apurinicandapyrimidinicsites,无嘌呤和无嘧啶位点）,在该位点5端切开，核酸外切酶从53方向切除脱氧核糖残基。由DNA聚合酶和连接酶修复缺口,38,2、核苷酸片段切除修复,原核生物参与切除修复的酶及蛋白质,UvrA、UvrB(辨认和结合DNA损伤部位)UvrC(去除损伤链)pol(填补空隙)DNA连接酶(连接缺口),真核生物除去损伤链：XP蛋白,39,切除修复过程（E.coli）,40,三、重组修复(recombinationrepairing),当DNA分子的损伤面较大时，来不及修复完善就进行复制，损伤部位因无模板指引，复制的新子链会出现缺口。重组蛋白RecA将另一股健康的母链与缺口部分进行交换，以填补缺口。健康的母链产生的缺口由polI和连接酶复原。原有的损伤仍存在，但随着多次复制，损伤的比例越占越少。,P71,41,重组修复,42,四、SOS修复,SOS是国际海难信号，在此用以表示应急性的复制方式。除了需要复制、修复的酶系统外，还需重组蛋白RecA及调控蛋白LexA（抑制与SOS修复有关的基因表达）。机制：DNA严重受损时，RecA作为蛋白水解酶使LexA蛋白水解，从而解除与SOS修复有关的基因的抑制，修复酶系大量表达。,P71,43,SOS修复系统对碱基的识别、选择能力差，是以牺牲复制的准确性而换取细胞的生存，使DNA保留的错误会较多，从而引起广泛、长期的突变。这是SOS修复的主要特点。人类细胞中尚未发现这种修复系统。,P71,44,SOS修复机制,SOS修复无模板指导的DNA复制,大剂量的紫外线照射，大量的二聚体产生,SOS系统诱导，错误潜伏的复制超越二聚体而进行,45,RecA-P三种功能,46,当DNA复制受阻/DNAdamaged,47,SOS修复只是SOS反应的一部分,RecA在SOS反应中起核心作用,RecA与LexA组成调控环路,RecA受LexA的部分抑制,48,当DNA复制度过难关后,49,五、细胞周期检查点控制是真核生物诱导修复的主要机制,真核细胞有复杂的控制体系，DNA受损时，往往无法依靠单纯的修复机制进行修复，需要通过细胞周期检查点控制(checkpointcontrol,又称关卡控制）来对DNA损伤作出应答。,细胞周期检查点控制机制最早在酵母细胞中发现,50,当DNA损伤发生在复制期（S）和有丝分裂期（M）这两个细胞周期的重要时相时，细胞除了诱导修复基因的转录外，还可暂时阻断细胞周期，防止损伤DNA继续复制，如无法复制，则可以诱导细胞进入凋亡。真核生物通过细胞周期检查点控制机制来准确控制应答时序，协调应答过程，从而诱导修复基因的转录，或暂时阻断细胞周期，或诱导细胞凋亡。,51,（一）酵母细胞的细胞周期检查点控制机制,损伤发生在G1、G2期，细胞周期检查点控制的四种相关基因是：rad9、rad17、rad24、mec3。它们接受DNA损伤信号，下传给mec1和rad53。,mec1和rad53蛋白激酶基因，是信号传导中的两个关键基因。RAD53位于MEC1下游，可能直接阻断细胞周期于G1、S。,52,DNA损伤发生在S期时，细胞周期检查点控制的相关基因是另外三种：pol2、rfc5、dpb11。pol2编码DNA聚合酶，RFC5就是复制因子C，DPB11的作用尚不明确，但它是阻断复制必需的因子。,53,在DNA损伤应答过程中，rad53表达产物被磷酸化激活的过程有赖于POL2、RAD9和MEC1。若损伤发生在S期，主要依靠POL2方式应答。若损伤发生在G1、G2期，则主要依靠RAD9、RAD17、RAD24和MEC3方式应答。细胞通过上述机制对DNA损伤产生选择性反应和阻断DNA复制。,54,DNAdamageinG1andG2phage,DNAdamageinSphage,RAD9RAD17RAD24MEC3,POL2RFC5DPB11,MEC1,TEL1,RAD53,55,（二）哺乳类动物的细胞周期检查点控制机制,哺乳动物的相关控制基因是：p53、p21和atm（突变共济失调毛细血管扩张症基因）。,p53是一种抑癌基因，可调节其他损伤应答相关基因的表达，在DNA损伤应答中起关键作用。紫外线照射后，野生型细胞（p53+/+）的细胞周期阻断在G1期，而缺失p53的细胞（p53-/-）无此现象。研究发现，p53的应答作用是通过其下游效应基因实现的。,56,DNAdamage,p53,P21,Bax,Gadd45,CDK/cyclin,blockingcellcycleG1,cellapoptosis,Gadd45-PCNA,excisionrepairing,57,P21通过与CDK/cyclin结合抑制CDK2和CDK4的活性，后两者是细胞周期从G1转入S期所必需的周期蛋白依赖性蛋白激酶，从而P53通过调节P21/CDk/Cdk可诱导细胞周期阻滞于G1期。P53还可以通过调节Bax的表达来诱导细胞凋亡，Bax为细胞凋亡基因。p53能够调控gadd45基因表达，Gadd45不仅具有促核苷酸切除修复作用，还可以通过与细胞核增殖抗原（PCNA）的相互作用阻断细胞复制，阻断细胞周期。PCNA参与DNA复制和DNA损伤的切除修复，它既是DNA聚合酶和的辅助因子，又是DNA复制复合物的成员。众多相关基因协同表达，可调节DNA复制、阻断细胞周期或引起细胞凋亡。,58,第三节生物标记物可作为DNA损伤和修复的参考标志,P72,59,一、甲基化损伤修复相关基因的突变可作为甲基化损伤的基因型标记物,烷化剂使G甲基化变成O6-甲基鸟嘌呤，可以与T配对，造成碱基错配。,重要的修复酶：O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（MGMT）,MGMT基因高度保守，其调节序列的突变是导致MGMT表达水平改变的重要原因，并因此导致对烷基化损伤修复的个体差异。MGMT突变可作为甲基化损伤的基因型标记物。,60,二、切除修复相关的酶和基因可作为切除修复的生物标记物,碱基切除修复：尿嘧啶糖基化酶为主要始动因素核苷酸切除修复：着色性干皮病A蛋白始动,切除修复基因：大肠杆菌Uvr基因家族：rad1、rad2、rad3、rad4、rad7rad10、rad14、rad16、rad23、rad24、rad25、mmsl9人ecrr基因：ecrr1-6等6个基因切除修复基因：xpa-h等8个基因放射线敏感基因：atm、bcra2、p53等均可作为切除修复的生物标记物,61,三、错配修复相关基因可作为检测错配修复功能的生物标记物,62,遗传性非息肉型结肠癌（HNPCC,多发性家族性结肠癌）,HNPCC中，错配修复缺陷是癌变的第一步。对其家族的前瞻性研究发现MLH1、MSH2的MI（微卫星序列的不稳定性）在肿瘤及癌前病变的病人中明显升高，表明MI对HNPCC的发生有预测作用，可作为检测错配修复功能的基因标记物。,P72,63,四、DNA聚合酶突变可作为碱基切除修复功能缺陷的标记物,DNA聚合酶不参与染色体DNA复制，但参与辐射损伤和化学损伤的修复，并对细胞生长具有调节作用，该酶的突变导致碱基切除修复功能的缺陷。,64,五、Ku蛋白和Rad52蛋白缺陷可作为重组修复缺陷的标记物,重组修复是大片段DNA损伤后的重要修复方式，虽然准确性较差，但可以避免损伤导致的细胞立即死亡。Ku蛋白是双链断裂平端修复的必需蛋白，Rad52蛋白是双链断裂同源重组修复的重要参与者。已发现同源重组修复缺陷的胃细胞癌变的可能性增加。核内核酸外切酶也参与重组修复。,65,第四节DNA损伤、修复与人类疾病,P72,66,一、核苷酸切除修复与着色性干皮病,P72,着色性干皮病（xerodermapigmentosum，XP）无法修复紫外线造成的损伤,核苷酸切除修复相关基因：XPA、B、C、D、E、F、G其中任何一个基因突变都可以引起XP病。,细胞融合实验发现：来自于不同患者的皮肤成纤维细胞对紫外线损伤的修复有互补作用，甚至可以使核苷酸切除修复能力恢复正常。,67,XP病人和正常人中皮肤癌发生的年龄分布,Kraemer,PNAS,1997,Skincancersinnormalpopulation,SkincancersinXPpopulation,XP=xerodermapigmentosum,68,二、错配修复与遗传性非息肉型结肠癌,P72,HNPCC是最常见的遗传性肿瘤之一，是常染色体显性遗传疾病，其癌瘤细胞常表现出微卫星DNA的不稳定性，长度较正常细胞或长或短。微卫星DNA的不稳定性在多个位点存在，可以作为错配修复功能缺陷的标志。HNPCC家族中表型正常者，其错配修复基因只有一个拷贝失活，有较高肿瘤易发性。当基因的第二个拷贝失活时，错配修复能力丧失，导致高突变表型出现。修复能力的降低使其无法修复癌基因、抑癌基因关键部位的突变，有利于细胞恶性生长。,69,三、转录偶联修复与Cockayne综合征（CS）,P72,转录偶联修复（transcription-coupledrepair,TCR）1982年提出。转录过程有利于DNA损伤修复的进行，基本转录因子(TFH)是转录启动所必需的，也是参加核苷酸切除修复不可缺少的蛋白质因子。修复与转录过程的偶联通过转录修复偶联因子(transcriptionrepaircoupli