细菌病毒培养技术

细菌培养技术,1细菌的培养基本知识2细菌的规模化培养3细菌的计数技术,对氧气要求：专性需氧菌微需氧菌兼性厌氧菌专性厌氧菌对CO2要求：5%CO2,水碳源氮源无机盐生长因子有些细菌需要,（一）细菌生长繁殖的条件,4、对气体要求,4、PH,1、营养物质,2、温度,3、渗透压,（二）细菌生长繁殖的方式,二分裂法,繁殖方式：,链球菌,八叠球菌,葡萄球菌,（三）细菌生长繁殖的速度,（四）细菌生长繁殖的速度,分为四期：迟缓期、对数期、稳定期、衰退期,（五）常用培养基种类,厌氧培养基,基础培养基,增菌培养基,选择培养基,鉴别培养基,细菌培养技术,1细菌的培养基本知识2细菌的规模化培养3细菌的计数技术,二、细菌的规模化培养,种子接种是指菌体增殖培养物。收获时间最佳培养时间依据细菌的生长曲线而定。,对数生长期,培养方法,1固体培养基表面培养法用于制备抗原、灭活苗、冻干苗。2液体静置培养法需氧菌（深度1/2）和兼性厌氧均可用，厌氧菌（深度3/4），还需加肝块。3深层通气培养法是目前菌苗生产的主要培养法。安装有自动控温、消泡、调pH、自动控制通气量、自动磁力搅拌等装置。细菌接种12h，再通入滤过除菌空气，并适当搅拌分散通入的气体，以增加培养液中的溶氧量。及时补充营养。,4透析培养法在细菌培养液与培养基之间隔有一层透析膜，使培养基中高浓度小分子量的营养成分通过透析膜（不能透过大分子的细菌或毒素）不断扩散到细菌培养液中，供细菌生长繁殖，获得高浓度的细菌或毒素。,透析器,1.螺栓2.培养基贮存室3.视镜4.透析膜5.培养室,5、连续培养,连续培养系统是一个恒定体积的流动系统，新鲜培养基以恒定的速度流入，又以相同的速率流出除去多余的液体，细菌始终保持在对数生长期。,细菌培养技术,1细菌的培养基本知识2细菌的规模化培养3细菌的计数技术,三细菌的计数技术,细菌性疫苗在制造中，往往需要计算每毫升所含细菌的总数。1.显微镜直接计数法2.活菌计数法倾注平板培养法将被测样品根据菌数含量多少，用普通肉汤或生理盐水作10倍递进稀释。分别取其1ml加在灭菌的平皿中，然后取预先加热融化且冷至4550，立即摇匀放平，凝固后培养，统计平皿上长出的菌落数，乘以稀释倍数，即为每毫升样品中含有的活菌数。,平板表面散布法接种量为0.1ml琼脂板的制备稀释菌液接种培养计数选择菌落数在30300之间的平皿用以计数，每个稀释度应取其菌落平均数。活菌数ml=2个平板平均菌落数10稀释倍数。举例：在10稀释的平板中所得平均菌落数为78个。计算结果：781010=7.810个活菌ml微量点板计数法接种量为0.02ml,10,-8,-8,3比浊计数法是对比细菌悬液与标准管的浊度，求出大致的菌数。原理：菌液中含数多少与其浑浊度成正比。方法：比浊管比浊法和分光光度计法。优点：快速简便应用：常用于菌苗及其他生物制剂的生产、细菌毒力的测定和攻毒量的确定等。,标准比浊法,比浊管由国家生物制品检定部门提供，每套包括一支细菌比浊标准管、数支对照空管和一张比浊用的图片。比浊方法将空管拭刷干净，加入待测菌液1ml。将标准管与待测管并列紧贴在图片前，使两管受光均匀，然后透过两管管壁对比观察，目测图片的清晰度，并将两管左右换位，反复对比。例如：测定大肠杆菌的菌数，若1ml菌液加入4ml的生理盐水后，与标准管的浊度相同，即表示该菌液经5倍稀释后相当于标准管。大肠杆菌标准管的菌数相当于8亿个ml，故被测菌数为85=40亿个ml。,分光光度计法,借助于分光光度计。在一定波长下测定菌液的光密度值注意：测量时一定要控制菌浓度与光密度成正比的线性范围内，否则不准确。,病毒培养技术,1病毒的复制2病毒的动物培养技术3病毒的禽胚培养技术4病毒的细胞培养技术,病毒复制：以病毒基因为模板，在酶的作用下，分别合成基因和蛋白质，再组装成完整的蛋白颗粒，这种方式称为复制（replication)。,吸附,侵入,早期：病毒特异性酶的合成,病毒核酸复制,病毒结构蛋白质合成,装配,释放,病毒大分子合成,病毒培养技术,1病毒的复制2病毒的动物培养技术3病毒的禽胚培养技术4病毒的细胞培养技术,1病毒的动物培养技术,动物的选择应当选择SPF动物。选择动物的条件下：选用对病毒易感性高。动物健康、体重、年龄尽可能一致，符合培养病毒要求。遗传特性相似，实验结果具有一致性、准确性和可比性。外购动物要了解当地动物群健康，饲养及免疫接种情况，接前要经过健康观察，以免误用带有病原体动物。,1.皮内接种2.皮下接种3.肌肉接种4.静脉接种5.腹腔接种,动物接种途径和方法,动物接种后的饲养管理与收获病毒,1.接种病毒后的动物,每天观察和检查规定的各项指标，主要有精神、食欲、粪便、尿液、被毛状态、活动情况和接种部位的局部反应，每天测体温1次，做好记录。2.出现反应症候动物，按规定方法剖杀，采取含病毒高的组织脏器。,病毒培养技术,1病毒的复制2病毒的动物培养技术3病毒的禽胚培养技术4病毒的细胞培养技术,2病毒的禽胚培养技术,操作要点,1禽胚的选择理想的禽胚是SPF鸡胚，常以非免疫鸡胚补充。2禽胚的接种前孵育孵化前消毒，温度37.538.5，相对湿度50%60%，定时翻蛋，保证通风。孵化45d照蛋检查，淘汰无精蛋和死胚，孵化至所培养病毒需要的日龄即可接种。,3禽胚的接种途径,痘病毒和疱疹病毒，1013日龄,流感、新城疫、传支等，911日龄,鹦鹉热衣原体和立克次氏体等，68日龄,正粘病毒和副粘病毒，1011日龄,4禽胚的接种后孵育,接种后，蜡泪封孔，置37下孵化，每天照蛋2次以上，通过禽胚的病变初步确定病毒的存在及增殖情况，淘汰24h内死胚。,操作要点,病毒感染指征：,死亡,充血、出血或出现坏死灶,畸形,出现痘斑,5病毒的收获,操作要点,绒毛尿囊膜接种,尿囊膜接种,卵黄囊接种,羊膜腔接种,照蛋,任务实例病毒的尿囊腔接种培养技术,尿囊腔接种法,接种部位消毒,任务实例病毒的尿囊腔接种培养技术,尿囊腔接种,任务实例病毒的尿囊腔接种培养技术,收获尿囊液每枚鸡胚收获尿囊液68ml,任务实例病毒的尿囊腔接种培养技术,病毒培养技术,1病毒的复制2病毒的动物培养技术3病毒的禽胚培养技术4病毒的细胞培养技术,细胞培养技术（cellculture),细胞培养技术是选用各种细胞的最佳生存条件对活细胞进行培养和研究的技术。即：利用机械、酶或化学方法使活体动物组织或传代细胞分散成单个乃至24个细胞团悬液的培养，使之能继续生存、生长、增殖的一种方法。广义上:还包括组织培养、器官培养。,3病毒的细胞培养技术,细胞培养的方式原代培养：从直接取自生物体细胞、组织或器官开始的培养。次代培养：将原代细胞培养物轻微消化后，再洗下分装至含新鲜培养液的培养管中继续培养。传代培养：将培养细胞以一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶中进行培养。,培养常用的细胞,上皮细胞、成纤维细胞根据培养细胞的染色体和繁殖特性，可分为：原代细胞直接利用新鲜动物组织经胰蛋白酶消化、分散，获得单个细胞，如鸡胚成纤维细胞，此细胞对病毒的检测最为敏感，但制备和应用不方便。二倍体细胞（细胞株）由原代细胞或次代细胞选育出具有特殊生物学性质和标记的细胞，如猪肾细胞株（PK-15）和乳仓鼠肾细胞株（BHK-21）等。适用于病毒性生物制品的制备，常用于疫苗生产，安全可靠。传代细胞（非二倍体细胞系、异倍体细胞）指不再保持原来细胞的二倍体细胞数，在体外可以无限传代的细胞，如人子宫癌细胞（HeLa细胞）和鼠肾腺癌细胞（RAG细胞）等。有致癌性，不能用于疫苗生产，多用于病毒的分离鉴定。,1.培养液：生长液、维持液，Eagle氏液、RPMI-1640、199、DMEM、MEM等营养液。2.细胞接种量:适宜。3.pH：一般为7.07.4因细胞种类不同而略有差异。4.温度：一般为3738。5.气体：氧气和二氧化碳。6.无菌条件：培养的全过程都要求严格的无菌条件。,细胞培养的基本条件,各种组织是靠细胞间质黏合而成的，要获得分散的细胞，必须破坏细胞间质。分散细胞的方法的三种：机械分散法：适用于细胞间连接较松的组织，如禽胚组织。酶消化法：此法适用于原代细胞的制备及细胞的传代培养。螯合剂分散法：一般只用于单层细胞的分散。,分散细胞的方法,1.单层细胞培养法用胰酶将剪碎的组织或传代细胞分散成26个成团的细胞，接种到培养瓶或培养板上，让细胞贴壁生长，静置培养或转瓶生长培养。2.悬浮细胞培养法（搅拌培养）通过振荡或转动装置使细胞始终分散悬浮于培养液内的培养方法。3.微载体培养通过搅拌悬浮在培养液内，使微小细胞在载体表面繁殖成单层的一种细胞培养技术，兼有单层和悬浮细胞培养的优点。,细胞培养方法,犊牛肝脏单层细胞,病毒培养技术,细胞的选择选择相应易感动物的组织细胞。细胞培养病毒条件血清：促进细胞生长和贴壁的成分。温度：多数为37。pH值：pH在7.67.8接毒量与