试验二质粒DNA电泳鉴定-武汉大学药学院ppt课件

.,1,实验二质粒DNA电泳鉴定,生物技术制药实验,武汉大学药学院实验教学中心生物技术实验室,主讲教师：刘永梅刘永平,.,2,实验目的,掌握琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理；学习琼脂糖凝胶电泳的操作方法,.,3,实验原理及背景知识简介,电泳是分离和纯化DNA片段的最常用技术。如DNA制备、浓度测定、目的DNA片段分离，重组子的酶切鉴定等均需要电泳完成。根据分离的DNA大小及类型的不同，DNA电泳主要分两类：聚丙烯酰胺凝胶电泳适合分离1kb以下的片段，最高分辨率可达1bp，也用于分离寡核苷酸，在引物的纯化中也常用此中凝胶进行纯化，也称PAGE纯化。琼脂糖凝胶电泳可分离的DNA片段大小因胶浓度的不同而异，胶浓度为0.50.6%的凝胶可以分离的DNA片段范围为20bp50kb。电泳结果用溴化乙锭（EB）染色后可直接在紫外下观察，并且可观察的DNA条带浓度为纳克级，而且整个过程一般1小时即可完成。由于该方法操作的简便和快速，在基因工程中较常用。,.,4,琼脂糖凝胶电泳,琼脂糖是一种线性多糖聚合物。浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。,.,5,分离原理,DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同的DNA，分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系可依据DNA分子的大小使其分离,.,6,DNA分子在高于等电点的PH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。在一定电场强度下，DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数成反比。,电泳原理,.,7,DNA电泳影响因素（一）,DNA分子大小DNA分子越大在胶中的摩擦阻力就越大，泳动也越慢，迁移速率与线状DNA分子质量的对数值成反比。DNA分子构型构型不同，电泳时受到的阻力不同，导致泳动速率的不同。常规电泳中质粒DNA分子的3种构型泳动速率：超螺旋最快、线状分子次之，开环分子最慢。胶浓度对于同种DNA分子胶浓度越高，电泳速率越慢。浓度较稀的胶线性范围较宽，而浓的胶对小分子DNA片段呈现较好的线性关系。所以常规实验中对于小片段DNA分子的分离采用高浓度的胶分离（有时甚至用2的凝胶），而对于分离大片段则用低浓度的凝胶。,.,8,DNA电泳影响因素（二）,电场强度一般约为5V/cm。分辨率不高。在精确测定DNA分子大小时，应降低电压至1V/cm。电场强度偏高，分离的线性范围变窄，也会大量产热导致DNA片段的降解。选择合适电压，如对于大片段DNA的分离可选择较低电压进行（在Southern杂交中的DNA电泳），避免托尾现象的产生；而对于小分子DNA，由于其在凝胶中的快速扩散会导致条带模糊，可选用相对较高的电压以缩短电泳时间。溴化乙锭EB，具有扁平结构，能嵌入到DNA碱基对间，对线状分子与开环分子影响较小而对超螺旋态的分子影响较大。当DNA分子中嵌入的EB分子逐渐增多时，原来为负超螺旋状态的分子开始向共价闭合环状转变，电泳迁移速度由快变慢；当嵌入的EB分子进一步增加时，DNA分子由共价闭合环状向正超螺旋状态转变，这时电泳迁移速率又由慢变快。这个临界点的游离EB质量浓度为0.1g/ml0.5g/ml，即电泳时所加的浓度。对于特殊电泳，消除此因素影响可采用电泳后染色。,.,9,电泳缓冲液目前有3种缓冲液适用于天然双链DNA的电泳：TAE、TBE和TPE，其组成及特点见表2.2。一般常用的DNA电泳选用TAE较多，其电泳时间较快，而且成本比较低，但是其缓冲容量较低，需经常更换电泳液。,DNA电泳影响因素（三）,.,10,琼脂糖凝胶电泳中常用的缓冲液,Tris-硼酸（TBE）Tris-乙酸（TAE）Tris-磷酸（TPE）,.,11,电泳指示剂溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成上样缓冲液。作用：增加样品比重，以确保DNA均匀沉入加样孔内。形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置。使样品呈色，使加样操作更方便。,上样缓冲液,.,12,溴化乙锭（EB）是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。其荧光强度与DNA的含量成正比。据此可粗略估计样品DNA浓度。琼脂糖凝胶EB染色，肉眼可见核酸电泳带，其DNA量一般5ng。,核酸染色剂,注意事项：EB是致癌物质，切勿用手接触，更不要污染环境。,.,13,实验材料及器材,提取的大肠杆菌质粒DNA电泳仪，水平凝胶电泳槽和梳子及其制胶模块，电子天平，凝胶成像系统，移液器，枪头，三角瓶，点样板，微波炉等琼脂糖，TAE电泳缓冲液，载样缓冲液（Loadingbuffer），EB存储液，电泳级琼脂糖粉，DNA分子量标准,.,14,微波炉溶胶用,实验仪器,.,15,凝胶电泳仪及电泳槽,.,16,凝胶成像系统,.,17,实验准备工作,配制TAE电泳缓冲液（50储存液，pH约8.5：Tris碱242g，57.1ml冰乙酸，37.2gNa2EDTA.2H2O，ddwater定容至1L）1000溴化乙锭储存液（0.5mg/ml：50mg溴化乙锭溶于100mLddwater，4C避光储存）10加样缓冲液（20%Ficoll400，0.1mol/LNa2EDTApH8.0，1.0%SDS，0.25%溴酚蓝）；1.5ml离心管、移液器吸头灭菌。,.,18,实验步骤（一）制胶,（1）称取0.5g琼脂糖粉，放入三角瓶，加入50mlTAE电泳缓冲液(1)，微波1min煮沸。50ml制备两块小胶。（注意观察烧瓶中的琼脂糖粉末，待完全熔化后停止微波炉）（2）平衡凝胶槽，放好两侧挡板，调节好梳子与底板的距离（一般高出底板0.51mm）。（3）铺板：在溶解好的凝胶中加入终浓度为0.5ug/ml的溴化乙锭水溶液，轻轻混匀，待冷至50左右倒入凝胶槽，胶厚一般为58mm。静置10-20min。（4）待胶彻底凝固后，去掉两侧挡板，将凝胶放入盛有电泳液的槽中（加样孔朝向负极端，DNA由负极向正极移动），使液面高出凝胶23mm，小心拔出梳子。,.,19,.,20,实验步骤（二）点样,（5）剪1片光面纸（或封口膜），将DNA样品与6加样缓冲液5：1混合。若样品浓度较高，可加蒸馏水稀释。如3l蒸馏水、1l10加样缓冲液，再加入2l质粒DNA溶液制成6lDNA样品。（6）将混合好的样品3-5l加入凝胶的凹孔中，同时加入1.5-3lDNA分子量标准物。加样时持移液器的手以肘部固定在桌上，用另一只手扶住这只手的手腕，以减少移液器的抖动。看到蓝色的样品吸管尖头伸进加样孔后（不能伸得太深，以免穿破凝胶的底部）缓缓将蓝色的样品压入加样孔中。切不可使蓝色样品流到孔外。,.,21,.,22,实验步骤（三）电泳分离及结果观察,（7）根据电泳槽的长度把电泳仪的电压调至170V(10V/cm)，注意正负电极的位置连接正确。（8）打开电源开关，样品将形成一条蓝色的横带向前移动。电泳将进行约30min。（9）据指示染料移动的位置，确定电泳是否终止。当蓝色的溴酚蓝迁移到距凝胶边缘1cm时，关闭电源。（10）将凝胶放紫外灯下观察并拍照，时间不宜太长。,.,23,.,24,.,25,DNA电泳图谱,常用DNA分子量标准物,样品电泳结果,.,26,注意事项,1倒胶时把握好胶的温度，不要高于60，否则温度太高会使制板变形；倾