细胞培养与病毒培养实验步骤

实验二继代细胞培养与病毒在继代细胞中的培养一、实验目的了解倒置显微镜的结构和使用，了解不同继代细胞的形态和接毒后病变的特点，掌握细胞的继代培养方法、病毒接种方法和接毒方法。二、常用细胞的种类BHK-21 :仓鼠肾继代细胞PK-15 :猪肾继代细胞IBRS-2 :猪肾继代细胞Hela :人子宫瘤细胞Vero :非洲绿猿肾细胞Marc-145 :来自Vero细胞TK-143 :人胸苷激酶阴性细胞Sf9 :昆虫细胞三、材料100ml细胞瓶，吸管，吸球，96孔细胞培养板，取样器，枪口2，bhk-21细胞3，0.25 %胰酶4、生长液： 10%小牛血清，200U/ml蓝，含链霉素DMEM维持液：2-5%小牛血清，200U/ml蓝，含链霉素DMEM5、伪狂犬病病毒液(PRV )四、继代细胞培养的条件要求1 )细胞密度：2-3105个/ml2)pH范围以pH7.0-7.4为最佳，可承受pH6.6-7.83 )培养温度哺乳动物细胞一般为37昆虫细胞28-30五、常用细胞分散剂和作用原理1、胰酶使精氨酸或赖氨酸羧基与其他氨基酸氨基之间的多肽链水解，使细胞间质水解，使细胞或组织块消化成分散的单一细胞。2、乙二胺四乙酸二钠(EDTA ) :与二价钙、镁离子结合，分散细胞。3、灰链霉菌酶：从灰链霉菌中提取的酶制剂是蛋白酶、氨肽酶和羧肽酶的混合物。六、营养液1 .人工综合营养液氨基酸、糖类、无机盐类、维生素、辅酶、嘌呤、嘧啶、辅助生长因子。2、血清1 )血清的种类在胎牛血清、新生犊血清、成年牛血清、马血清、鸡血清、兔血清、羊血清、人血清中，新生犊血清应用最为广泛。2 )血清的处理无菌采集，过滤除菌。 前56灭活30min。3 )血清的作用a .能够提供细胞生存、生长和增殖所需的生长调节因子。b .可以补充基础培养液中不足或不足的营养成分。c .依赖于壁的细胞含有在培养器表面附和扩散的生长基质成分。d .中和毒性物质有保护细胞免受伤害的作用。e .为培养液提供良好的缓冲系统。f .提供蛋白酶抑制剂，保护细胞免受细胞释放蛋白酶的损害。4 )血清的应用存在问题a、血清中存在大量对细胞生长和繁殖有害的物质：补体、免疫球蛋白、生长抑制因子。b、血清成分不明，影响结果分析。c、不同动物、不同批次血清成分和活性差异较大，培养结果不稳定。七、传代细胞系培养1、优点：1)可以有无限的传代。2 )许多细胞系对病毒敏感。3 )某些传代细胞系可以在悬浮培养条件下培养，适合病毒抗原的大量生产。4 )生长旺盛，繁殖快，营养条件不严格。2、缺点：传代过程中被支原体和病毒污染。3 .培养方法1 )取出一根单层细胞，倒入培养液。2 )加入2)2ml胰酶消化液，在37的培育箱中放置数分钟，细胞间隙和细胞变圆后，注入消化液。3 )加入生长液，反复吹气，使细胞分散在一个细胞中，然后分装到3个小瓶中。 在每个小瓶中补充10ml生长液，在37的培养箱中培养，1天到2天生长成单层。八、病毒(PRV )在传代细胞中的培养1 .选择单层细胞，丢弃培养液。加入适量的病毒悬浊液3、在温箱上放置致敏(吸附) 45min-1h。4 .取出瓶子，不要抛弃或抛弃培养液，补充维持液，放入温箱继续培养，达到80%以上的细胞病变。5、中毒：将病变细胞放入-20冰箱，冻结后取出自然解冻，解冻过程中摇晃几次，细胞完全从瓶壁上脱落。 将病毒液收集到盐水瓶或其他容器中。 低温贮藏备用。实验三、原代细胞培养(以鸡胚成纤维细胞为例)一、实验目的了解不同原代细胞的形态，掌握鸡胚成纤维细胞的制备和培养方法。二、材料1，9-11日龄鸡胚2 .照亮卵灯和卵座3 .碘酊棉球和酒精棉球4、剪刀、眼科剪刀、镊子5、平皿、细菌瓶、吸管、吸球、细胞瓶、6、胰酶、生长液、维持液三、细胞培养的条件要求1 )细胞密度原代细胞：4-6105个/ml继代细胞：2-3105个/ml2)pH范围以pH7.0-7.4为最佳，可承受pH6.6-7.83 )培养温度哺乳动物细胞一般为37昆虫细胞28-30四、操作步骤1、9-12日龄培育出良好的鸡胚，用碘酊和酒精消毒气室部。2 .无菌操作用剪刀去除气室部的蛋壳，去除壳膜，冲破绒毛尿囊膜，夹住鸡胚头，取出鸡胚放入灭菌盘。3、在眼科切除鸡胚头、四肢和内脏，用DMEM冲洗2次。4、用剪刀把洗好的鸡胚充分切开，接近乳糜状。5、将切碎的组织块放入玉米瓶、烧杯或青霉素瓶中，用DMEM充分清洗，静置数分钟，舍弃上层液体，加入DMEM直至组织块下沉。 这样反复清洗23次。6、在沉淀组织块中加入约4倍量的0.25%胰酶，将pH调整至7.6-7.8，振荡后在37水浴中感觉30分钟，每10分钟轻轻摇动使细胞完全消化(组织块散开，沉降缓慢时表示消化充分)。取出，静置数分钟，慎重吸引上层胰酶溶液，用DMEM轻洗2次后，加入生长液5ml，用大口径吸管反复喷射，使细胞游离。8、静置几分钟，使未消化的组织块下沉。9、细胞数取细胞悬浊液0.5ml 2ml 0.1%结晶紫柠檬酸(0.1mol/L )溶液，在室温或37的烘箱中振动5-10min，充分振动后计数。白细胞计数法计算四角四大眼内细胞总数(n )。ml悬浮液中的细胞数(n)=N/410000K (稀释倍数)。活细胞数必须在90%以上。10、将计数的细胞稀释成适当的浓度，分成细胞培养瓶，每瓶加入1ml、DMEM生长液，制成10ml，盖上盖子，放入37的恒温槽中培养。表示可计数表示不计数五、结果观察培养后，每天观察结果，直至长层单层。 细胞量多的话，一天就会生长成单层，细胞会变成纤维状。实验四病毒感染力的滴定(TCID50的测定)一、实验目的了解病毒感染力测定的一些常用方法，掌握一半细胞培养物感染量TCID50的操作步骤、计算方法和意义。二、测定病毒感染力的方法半数致死量LD50(50% lethal dose ) :用动物或鸡胚检测半数鸡胚感染量EID50(egg 50% infective dose ) :以鸡胚检测半数细胞培养物感染量tcid 50 (50 % tissuecultureinfectivedose ) :用细胞检测蚀刻斑形成单位(plaque forming unit，PFU ) :用细胞检测三、材料1、单层生长的细胞1根2、胰酶、吸球、吸管、生长液3，96孔细胞培养板4、取样器、枪口5 .病毒液(PRV )四、TCID50操作步骤用青霉素瓶或离心管把病毒液稀释10倍，从10-1-10-10开始。2 .将稀释后的病毒接种到96孔的微量培养板上，每稀释度接种纵8孔，每孔接种100l。3 .每个细孔加入100l细胞悬浊液，使细胞量达到23105个/ml。4 .作为正常细胞对照，以正常细胞对照为双纵列。 (100l生长液100l细胞悬浊液)每天观察，记录结果，一般需要观察57天。6、结果的计算采用先导-muench二氏法或Karber法五、TCID50的计算方法CPE :细胞病变效应1、导言-muench二氏法病毒液稀释度可产生CPE孔的数量无CPE孔数累计CPE厅所占比例CPE空穴数无CPE孔数10-180270100(27/27 )10-280190100(19/19 )10-37111191.6 (11/12 )10-4354640(4/10 )10-5171130.7(1/14 )10-6080210(0/21 )CPE:Cytopathic effect距离比率=(50%以上病变率的百分比-50%)/(50%以上病变率的百分比-50%以下病变率的百分比)=(91.6-50)/(91.6-40 )=0.8lgTCID50=距离比例稀释度对数之差高于50%病变率的稀释度对数=0.8(-1) (-3 )=-3.8TCID50=10-3.8/0.1ml意思：将该病毒稀释到103.8，接种100l，50%的细胞会发生病变。2、Karber法病毒液稀释度CPE出现的孔的数量产生CPE孔的比例10-188/8=110-288/8=110-377/8=0.87510-433/8=0.37510-511/8=0.12510-600/8=0lgTCID50=L-d(s-0.5 )l :最高稀释度对数d :稀释度对数之差s :阳性空穴比率合计lgTCID50=-1-1(3.375-0.5 )=-3.875TCID50=10-3.875/0.1ml意思：把这种病毒稀释到103.875，接种100l，50%的细胞会发生病变。实验5血清中和试验一、实验目的了解中和试验的基本原理和几种不同的测定方法，掌握固定病毒稀释血清法的操作步骤、计算方法和意义。二、原理抗体与相应的病毒粒子特异性结合，失去病毒的感染力。三、用途1 .疾病诊断2 .病毒分离株的鉴定3 .不同病毒株抗原关系研究4 .疫苗免疫原性的评估5 .免疫血清的质量评价6 .测定实验动物血清中是否存在抗体四、分类(1)斑点(痘斑)减数试验将病毒正常血清混合物和病毒被检血清混合物分别接种到单层细胞中，然后营养琼脂和甲基纤维素，进行斑块测定，比较病毒正常血清组和病毒被检血清组中发生的斑块数，两者的差异显示被检血清的中和能力。以试验组食斑数比对照组减少50%为判断依据，血清稀释度是其食斑减数试验的有效价格。(2)交叉保护试验使实验动物成为积极免疫或被动免疫后，用被检病毒攻击，根据实验动物得到保护的情况，判定被检v的种类或种类。 该方法的缺点是试验周期过长，需要大量实验动物。 用已知的v鉴定未知的v用已知的免疫血清鉴定未知的v用已知的v鉴定未知的血清。(3)终点法中和试验1 .固定病毒稀释血清法将不同稀释度的血清与一定量的病毒液(一般为100个或200个TCID50、EID50或LD50 )混合，在适当条件下感知一定时间，将血清病毒混合物接种到敏感细胞、鸡胚或实验动物中，测定受检血清阻止组织培养细胞、鸡胚或实验动物病毒感染的能力及其有效价值将50%组织培养细胞、鸡胚或实验动物能够保护其免受病变、感染或死亡的血清的最高稀释倍数作为该血清的50%中和有效价值(PD50 )。2、固定血清稀释病毒法给一定量的血清加入同量不同稀释度的病毒，对照非免疫血清(对照组)和被检血清同时测定，计算各组的TCID50、EID50或LD50，计算中和指数。五、材料1、单层生长的细胞1根2、胰酶、吸球、吸管、生长液3，96孔细胞培养板4、取样器、枪口5 .病毒液(PRV )6 .检查对象血清、PRV阳性对照血清、PRV阴性对照血清六、操作步骤1 .固定病毒稀释血清法1 )测量病毒液体的TCID502 )将测定tcid50的病毒液稀释为200个tcid50的病毒悬浊液。3 )用96孔的微量培养板以连续倍数比稀释血清(预先在56下灭活30min ) (具体方法是在96孔板中加入50l的生长液，加入50l的检查对象血清，混合后，将50l吸入下一个孔。 到1256 )为止每稀释度取4孔。4 )在上述各孔中加入50l稀释的病毒液，混合后，放入37的5%co2培育箱中使其作用45min-60min。5 )同时设检测对象血清毒性对照、阴、阳性血清对照、病毒对照和正常细胞对照，其中病毒对照为200个TCID50、20个TCID50、2个TCID50、0.2个TCID50不同浓度的对照。6 )致敏结束后，每孔放入100l细胞悬浊液，在37的5%co2培养箱中培养，每天观察记录结果，一般观察57天。7 )结果计算采用reed muench二氏法或Karber法进行。血清稀释度CPE空穴数无CPE孔数累积保护率%CPE空穴数无CPE孔数12(10-0.3 )04015100(15/15 )14(10-0.6 )04011100(11/11 )18(10-0.9 )131787.5(7/8)116(10-1.2 )132