细胞因子检测

细胞因子检测细胞因子是免疫细胞和一些非免疫细胞被刺激合成、分泌的生物活性物质分泌的蛋白质，在体内广泛参与免疫调节、炎症反应、组织修复、造血系统刺激、细胞增殖和凋亡等重要生理活动，在抵抗外来病原、维持生物体内环境平衡方面发挥着重要作用。 一些刺激因子可引起细胞因子过度表达或表达减少，参与疾病的发病和病理过程。1、免疫学检查法的基本原理是以细胞因子为抗原进行定量检查。 例如免疫斑点法、ELISA法、RIA法、免疫印迹法等被用于细胞因子的检测。2 .生物学测定法的原理是基于细胞因子对特定依赖性细胞株(即靶细胞)的增殖促进作用，以增殖细胞中的DNA的合成或酶活性为指标，间接地推测细胞因子的活性单位，例如IL-1、IL-2等细胞因子活性的检测。 也可以测定某些细胞因子对某些靶细胞的杀伤效果以及对病毒的抑制作用，如肿瘤坏死因子和干扰素的生物活性测定等。3、分子生物学检测方法目前采用的技术有各种印迹法、斑点杂交、原位杂交和PCR等。 通过测定细胞内细胞因子的基因组成和mRNA量，推测细胞因子的合成量。一、IL-1的检测(生物活性测定)产生IL-1的细胞种类很多，其中最主要的是单核巨噬细胞。 IL-1分为IL-1(酸性IL-1，也称为pI=5.0 )和IL-1(中性IL-1，pI=7.0 )。 两者的分子量和生物活性相似，只能用抗体检测法区分，常用的生物测定法适用于两者。 IL-1的生物学活性广泛，检测方法多，有小鼠胸腺细胞增殖法、D10G 4.1细胞增殖法、L929细胞增殖法等。 IL-1反应细胞增殖可以以活性染料染色、显微镜直接计数、3H-TdR或125I-UdR的DNA混入量或活性细胞代谢率为指标来表示。 本实验介绍了L929细胞增殖MTT比色法。(IL-1的诱导体外试验采用LPS等有丝分裂原从单核巨噬细胞诱导il-1，或由P388D1 (小鼠)、THP-1 (人)细胞株制备il-1。 本试验采用小鼠巨噬细胞制备IL-1。取1、610周龄的BALB/c或C57BL/6鼠，雌雄均可，牵头处死后用酒精消毒。使用带有2、9号针的5ml注射器，向腹腔内注入含有5%的小牛血清的Hanks液(5%NBS-HBSS )，轻轻揉捏腹部吸引腹腔内的液体(含腹腔细胞)，反复多次吸引。3，1500 r/min离心8min，洗涤细胞2次。4 .将腹腔细胞用含有10%犊血清的RPMI-1640液(10%NBS-RPMI-1640 )制成2106/ml，加入24孔平底培养板，放置1ml/孔、5%co2，在37的烘箱中孵育2h。每孔用5% NBS-HBSS冲洗3次，丢弃未附着细胞，带壁细胞为巨噬细胞单层。将LPS(10g/ml )放入巨噬细胞单层，每孔培养1ml，加入4h培养10%NBS-1640 1ml，培养至48h，收集上清液，放入-20的冰箱保存，测定IL-1的活性和含量。(L929细胞增殖MTT比色法MTT比色分析法的原理是将四甲唑盐3- (4.5dimethylethiazol2y1) 2，5 diphenyltetrazoliumbromide，mtt用活细胞线粒体琥珀酸脱氢酶还原成兰黑色的MTT甲，将MTT甲因此，通过测定细胞形成MTT-甲基量，可间接地定量分析细胞的增殖状况，具体步骤为：1 .用0.25%胰酶消化单层生长的L929细胞23min。 去除消化液后，将L929细胞用10% FCS的RPMI-1640制成1105/ml，放入96孔细胞培养板，每孔100l。取2，100l不同稀释度的IL-1标准品和测定品，放入各个孔中，每个孔设置3个包复孔，在37，5% CO2温箱孵化56h。3 .用PBS溶解5mg/ml的MTT，用0.22m膜滤器除去除菌及杂质。4、取出上述培养系统后，在1孔中加入10l MTT(5mg/ml )，在37下继续培养4h。5、每孔吸入100l的上清液，将异丙醇氧化，或者加入DMSO 100l/孔，能够混合溶解基质。 酸性条件使培养液中的酚红指示剂变黄，有利于MTT-甲基转化物的测定。6 .将微量测定板在室温下放置数分钟，保证转移的基质晶体溶解。7 .用酶标光度计测定波长570nm，参照波长630nm测定OD值。 测定在添加氧化异丙醇后1h以内进行。 OD570nm-OD 630nm，减去培养液对照的OD值。8 .将il-1标准品的各稀释度il-1的含量(x )和与各稀释度对应的OD值(y )作为直线回归，用上述概率单位分析法计算测定对象的IL-2的活性单位(u/ml )。(3)注意事项1、IL-1诱导剂的浓度、培养条件和细胞浓度对结果有明显影响，应进行预试验确定最佳实验条件。2、培养器和研磨条件： 24穴培养板培养细胞活性率高，但生长稍慢。 玻璃瓶培养有时会因玻璃质量和清洗不良而导致细胞死亡，必须注意其对策。 大量培养时使用大容量瓶很方便，可以减少操作中的污染。 研磨组织可以使用玻璃均化器、不锈钢网。二、TNF的检测(免疫学测定法、双抗体ELISA夹心法)(1)原理上选择1)rhutf-分子不同表位的2种单克隆抗体，以一种单克隆抗体为包复抗体，另一种单克隆抗体为酶标记抗体，测定对象试样中含有TNF-时，形成抗体-TNF-酶标记抗体复合体，通过酶催化剂基质的显色(二)材料和试剂；1 .使用包复抗体：时用包复缓冲液适当稀释。2、酶标抗体：用稀释液适当稀释。3 .标准品： rHuTNF-(10ng/ml )在使用时用稀释液倍比稀释。4、阴性对照液(未免疫小鼠Ig )。5、ABTS基质：2、2-azi nobis-(3- ehtylbenzthiozoline6- sulfonticacid )、2，2 -连氮双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)。6，96孔ELISA板。在7、0.15mol/L、pH7.4 PBS:中配合其他液体.8 .缓冲液： 0.05mol/L，包复pH9.6 Na2CO3-NaHCO3缓冲液。9、清洗液： 0.05%Tween 20-PBS。10、稀释液：4%PEG-清洗液(用于稀释标准品和酶标记抗体)。11 .基质缓冲液：0.1mol/L、pH5.0柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液。12，3 % h2o 2。13、血清、柠檬酸盐或EDTA抗酸血浆，其他体液和细胞培养上清均可检出，后者应适当稀释。14.ELISA读取器等。(3)操作步骤1、包衣是将稀释的包衣抗体放入ELISA板中，放置100l/孔、4$小时或48小时。2、加入样本清洗液清洗ELISA板3次，加入样本、阴性对照及倍率稀释的标准品、100l/孔、37%、1h .标准品稀释方法：标准品150l(10ng/ml )倍率稀释7个浓度：5ng/ml、2.5ng/ml、1.25ng/ml、625pg/ml、312pg/ml、156pg/ml、78pg/ml。3、加入酶标记抗体：洗涤板3次，加入稀释酶标记抗体、100l/孔、37、1h。洗3次显色：板，调制的ABTS显色液，100l/孔，室温或37下显色1530min。5、ELISA读取器测量410nm的ODD值，制成标准曲线。6 .从标准曲线测定样品中的TNF-含量。四、注意事项1、血清或血浆中残留的凝血块或红细胞被离心除去，不使用溶血或脂肪过多的血清。2 .标本可在28保存3天，超过3天放入-20或-70，避免反复冻融3 .分别用取样头吸取各标本，避免相互交叉。4、叠氮化钠(NaN3)对辣根过氧化物酶(HRP )具有灭活作用，本实验系统应避免使用。5、基质显色液需临时配制，双氧水应放在28，6个月内保存。:带试剂调制1. 0.15mol/L、pH7.4 PBSKH2PO4 0.2gNa2HPO412H2O 2.9gNaCl 8.0gKCl 0.2g加入双蒸水100ml2 .包缓冲液Na2CO3 1.59gNaHCO3 2.93g加入双蒸汽洒水1000ml3 .清洗液PBS 1000mltween 20.5毫升4 .稀释液清洗液100ml蛋白0.6mlPEG (聚乙二醇，MW6000) 2.0gNaCl 2.9g5 .基质缓冲液Na2HPO412H2O 1.79g拧柠檬酸1.29g加入双蒸水100ml6. ABS显色液ABTS 5mg毫克基质缓冲液10ml3%H2O2 20l三、IL-2的检测(基因的检测)细胞因子基因的检测包括其DNA的检测和mRNA表达的检测，常用的方法包括Southern印迹、斑点印迹、PCR、insitu杂交和insituPCR等Northern印迹和RT-PCR。 介绍了IL-2mRNA的测定(斑点杂交法)。 改性RNA后立即在硝酸纤维膜上点像，手动操作点像，也可以用斑点式点像器点像，与特异的探针进行杂交。 该方法可用于基因组中特定基因及其表达产物的定性和半定量分析。 其操作比南方印迹简单快捷，所需样品量少，可在同一薄膜上同时进行多个样品检测，适合临床应用。 也可以用来检查DNA。 但其缺点是无法鉴定所测基因的分子量。(一)主要试剂；1. RNA提取试剂：TRIZOL试剂(Gibcol，No.15596-026 )、DEPC水(Fluka，No.980210 )。2 .质粒提取试剂盒： (promega : wizardminiprepsdna，No.117 )3. DNA片段提取试剂盒：(La Jolla )4 .地高辛标记和检测试剂盒：(Boerhinger Mannheim，No.1093657 )5. IL-2 DNA探针6 .其他试剂(1) STE溶液0.1mol/L NaCl10mmol/L Tris.Cl(pH8.0 )1mmol/L EDTA(pH8.0 )(2)溶液 50mmol/L葡萄糖25mmol/L Tris.Cl(pH 8.0 )10mmol/L EDTA(pH 8.0 )配合100ml，高压灭菌15min，可贮藏于4(3)溶液 0.2mol/L NaOH (临用前用10mol/L贮存液稀释)1 % SDS (配合20 %储存液)拧紧盖子，将离心瓶倒转数次，充分搅拌内容物。 在室温下放置510min(4)溶液iii5mol/l乙酸钾60ml冰醋酸11.5ml水28.5ml制备的溶液对钾为3mol/L，醋酸根为5mol/L(5)含相应抗生素的LB培养基(6)氯霉素(0.25g/2ml) )最终浓度170g/ml(7)溶菌酶(溶解于10mg/ml、10 mmol/ltr is.clph 8.0 )1ml(8)无水乙醇(部分-20预冷).异丙醇. 75%乙醇(部分4预冷)(9) TE缓冲液(pH8.0 )(10)5mol/L LiCl 1.5ml(11)RNA酶、RPMI-1640、胎牛血清(FCS )、ConA (菜豆a )等(12)500l含有13%(W/V )聚乙二醇(PEG 800 )的1.6mol/L NaCl(13)3mol/L NaAc、饱和苯酚、氯仿：异丙醇(24:1 )(2)主要设备CO2培养箱：美国Forma Scientific产品无菌工作台：苏州净化设备公司产品图像处理分析装置：同济医大太阳公司产品低温高速离心机：上海离心机械研究所(IL-2质粒DNA探针的大量制备含1，IL-2质粒的DNA探针的提取将含有IL-2质粒DNA的单个菌落置于2个25ml LB培养基(含100g/ml Amp )中以37 220r/min挥夜(约16h )取菌液10ml和lb培养液10ml (包括100g/ml amp )37 150r/min振动4h氯霉素(最终浓度170g/ml )37 220r/min振动3h菌液放入300ml的离心管中离心在4 5000r/min10min离心处舍弃上清液，除去残液(吸水纸无菌)。每根管子加入50ml ste溶液(冰预冷)悬浮细菌后，用移液管移至50 m l离心管4 5000r15min离心丢弃上清液，加入5ml溶液I (冰预冷)悬浮细菌，加入1ml新制备的(pH8.0)溶菌酶(10mg/ml )轻轻摇动，在室温下静置5min加入溶液10ml，盖上盖子，注意不要使用涡流振荡器混合离心管数次的液体冰浴为10min，请勿摇晃加入7.5ml溶液iii (冰预冷)，轻轻摇动离心管几次进行混合冰浴2030min，完全沉淀，4离心4 12000r/min20min将上清液取入另外的50ml离心管，加入异丙醇0.6体积混合，在室温下静置15min室温5000r/min15min离心放弃上清用75%的乙醇清洗一次沉淀(不使沉淀悬浮)，注入乙醇，将吸水纸倒置使乙醇挥发用1.5ml的te(ph8.0)溶解沉淀，加入体积冰预冷的5M LiCl，后冰浴混炼10min4 12000r/min10min离心将上清液取入新的EP管，加入等离子体的异丙醇(约3ml )，充分混合，在室温下静置15min室温12000rmin10min离