细胞培养基本条件

细胞培养的基本条件1.合适的细胞培养基合适的细胞培养基是细胞体外生长和增殖的最重要条件之一。该培养基不仅为细胞生长和增殖提供细胞营养和基础物质，而且为细胞生长和增殖提供生存环境。2.高质量血清目前，大多数合成培养基需要补充血清。血清是细胞培养液中最重要的成分之一，含有细胞生长所需的多种生长因子和其他营养物质。3.无菌无毒的细胞培养环境无菌无毒的操作环境和培养环境是保证细胞体外培养成功的首要条件。由于缺乏对微生物和有毒物质的防御能力，体外培养的细胞一旦被微生物或有毒物质污染，或被代谢物质自身积累，就会导致细胞中毒死亡。因此，当细胞在体外培养时，细胞的生活环境必须保持无菌和无毒，细胞代谢物必须及时清除。4.恒定的细胞生长温度为了保持培养细胞的旺盛生长，必须有一个恒定和适当的温度。5.合适的气体环境气体是哺乳动物细胞培养和存活的必要条件之一。所需气体主要包括氧气和二氧化碳。细胞培养基的类型和基本成分细胞培养基有多种类型，根据来源分为合成培养基和天然培养基(目前使用的大多数培养基是合成培养基)，根据材料状态分为干粉培养基和液体培养基。干粉培养基应由实验者自己制备和灭菌，液体培养基由专业商家提供。用户可以直接使用，非常方便。1.合成培养基的主要成分包括氨基酸、碳水化合物、无机盐、维生素和其他辅助物质：氨基酸氨基酸是构成蛋白质的基本单位。不同种类的细胞对氨基酸有不同的要求，但有几种氨基酸不能由细胞自身合成，必须由培养液提供。这些氨基酸被称为必需氨基酸。谷氨酰胺是细胞合成核酸和蛋白质的必需氨基酸。在缺乏谷氨酰胺的情况下，细胞生长不良并死亡。因此，在各种培养液中有大量的谷氨酰胺。然而，由于谷氨酰胺在溶液中非常不稳定，它应该储存在-20的冰箱中，并在使用前加入培养液中。当含谷氨酰胺的培养液在4冰箱中储存2周以上时，应再次加入原始量的谷氨酰胺。碳水化合物碳水化合物是细胞生长的主要能量来源，其中一些是合成蛋白质和核酸的成分。主要有葡萄糖、核糖、脱氧核糖、丙酮酸钠和乙酸。无机盐培养液中无机盐的主要功能是帮助细胞维持渗透压平衡。此外，钠、钾和钙离子有助于细胞调节细胞膜功能。培养液的渗透压是一个非常重要的因素，细胞通常能耐受260-320 mOsm/kg。标准培养基的渗透压在这个范围内波动。特别注意：向培养液中添加其他物质可能会显著改变培养液的渗透压，尤其是溶解在强酸或强碱中的物质。当HEPES被添加到培养液中时，钠离子浓度应调节如下。缓冲系统大多数细胞需要7.2-7.4的酸碱度。然而，细胞培养的最佳酸碱度因细胞类型而异。成纤维细胞喜欢较高的酸碱度(7.4-7.7)，而传代细胞系需要偏酸性的酸碱度(7.0-7.4)。由于大多数培养液由碳酸氢钠(碳酸氢钠)和CO2系统缓冲，气相中CO2的浓度应与培养液中碳酸氢钠的浓度相平衡。如果气相或培养箱空气中CO2的浓度设定为5%，培养液中碳酸氢钠的添加量为1.97克/升；如果CO2的浓度保持在10%，培养液中碳酸氢钠的加入量为3.95克/升细胞培养瓶盖不应拧得太紧，以确保气体交换。HEPES是一种非离子缓冲溶液，在7.2-7.4的酸碱度范围内具有良好的缓冲能力，但它非常昂贵，在高浓度下可能对某些细胞有毒。HEPES缓冲液可与低浓度碳酸钠(0.34克/升)共用，以抵消额外添加HEPES导致的渗透压增加。在这种培养条件下，应该拧紧细胞培养瓶的盖子，以防止培养液中所需的少量碳酸盐扩散到空气中。大多数培养液含有酚红作为酸碱度指示剂，酸性培养液为橙黄色，碱性培养液为深红色。维生素在细胞培养中，尽管血清是维生素的重要来源，但在许多培养基中加入各种维生素以适应更多细胞系的生长。其他成分其他组件也包含在一些更复杂的文化解决方案中。例如，杂交瘤技术中常用的DMEM培养液需要补充丙酮酸钠和2-巯基乙醇(2-巯基乙醇，2-Me)。2-Me在细胞生长中起重要作用。有人认为它相当于胎牛血清，具有直接刺激细胞增殖的功能。2-Me的活性部分是硫氢化物，其重要功能之一是将血清中的含硫化合物还原为谷胱甘肽，谷胱甘肽能诱导细胞增殖，是非特异性激活。同时，避免了过氧化物对培养细胞的损伤。另一个重要作用是促进有丝分裂原和DNA合成的反应，并增加植物凝集素(PHA)对淋巴细胞的转化作用。它已被广泛应用于杂交瘤技术。此外，它也开始用于一些难以培养的细胞。2-Me是一种小分子还原剂，极易氧化。分子量为78.13，纯2-Me为无色有刺激性味道的液体，比重为1.110-1.120(Do20)，一般最终浓度为510-5M。通常配制成0.1M的储存液，每升培养液加入0.5毫升。液体培养基保存：液体培养基应保存在避光4的冰箱中，并在实验前预热至37。无血清液体培养基的有效期为12个月。随着储存时间的延长，液体培养基中的L-谷氨酰胺会慢慢分解。如果细胞生长不良，可以加入适量的L-谷氨酰胺。干粉培养基保存：冰箱在4避光，有效期为36个月。血清加入到细胞培养液中的血清包括牛血清、马血清、人血清等。其中牛血清是最常用的血清，分为胎牛血清和新生小牛血清。胎牛血清是从奶牛腹部取出的胎牛分离出的一种血清，价格昂贵。新生小牛血清是从尚未哺乳的新生小牛中分离出来的血清。如果制造商能做到这一点，新生小牛血清的质量与胎牛血清的质量相差不大。如果小牛出生后被哺乳，取自小牛的血清可能含有更多的生物活性物质，其质量明显不如前两者。血清的质量、类型和浓度可能影响细胞生长。不同批次的血清具有不同的支持细胞生长的能力，特别是对于克隆细胞的生长。某些批次的血清可能含有毒性或细胞生长抑制物质。因此，在购买大量血清前，有必要检测血清支持细胞的生长能力，然后购买大量相同批号、质量良好的血清，并注意以下几点：(1)需要长期保存的血清必须存放在-20-70的低温冰箱中。在4冰箱中的储存时间不得超过1个月。由于血清在冷冻时体积会增加10%左右，所以在血清冷冻到低温冰箱之前，必须预留一定的空间，否则容易发生污染或玻璃瓶冻裂。(2)一般制造商提供的血清是无菌的，不需要过滤和灭菌。如果在血清中发现悬浮物质，可以将血清加入培养液中一起过滤，而不是直接过滤血清。(3)瓶装血清的解冻应逐步进行。-20至-70低温冰箱中的血清应在4冰箱中溶解一天。然后移至室温，完全溶解后重新包装。在溶解过程中，必须轻轻均匀地摇动(注意不要产生气泡)，以使温度和成分均匀，并减少沉淀的发生。不要直接从-20到37解冻血清，因为温度变化太大，容易导致蛋白质聚集和沉淀。(4)热灭活是指将完全解冻的血清在56加热30分钟。加热期间需要定期摇动。这种热处理的目的是使血清中的补体失活。除非有必要，一般不建议进行这种热处理，因为热处理会导致血清沉淀显著增加，还会影响血清质量。补体参与反应包括细胞毒性、平滑肌细胞收缩、肥大细胞和血小板释放组胺、增强吞噬作用、促进淋巴细胞和巨噬细胞的趋化性和活化。(5)不要将血清在37放置太久，否则血清会变浑浊，血清中的有效成分会断裂，影响血清质量。(6)血清中的沉淀絮状物：主要由血清中的脂蛋白变性和解冻后血清中的纤维蛋白引起，这些絮状物不会影响血清本身的质量。以3000转/分的速度离心5分钟或不处理。微观“小黑点”:热处理后的血清，沉淀物的形成会显著增加。一些沉淀物在显微镜下看起来像“小黑点”，经常被误认为是受污染的血清。正常情况下，这个小黑点不会影响细胞生长，但如果怀疑血清质量，应立即停止，并更换另一批血清。细胞培养环境1.实验室设计细胞培养是一种无菌技术，它要求工作环境和条件必须没有微生物污染和其他有害因素。细胞培养室的设计原则是防止微生物污染和有害因素，要求工作环境干净、空气新鲜、干燥、无烟。细胞培养室的设计原则一般是无菌操作区位于室内运动较少的一侧，常规操作和封闭培养在一个房间进行，而清洗和消毒在另一个房间进行。2.公共设施和设备(1)洁净工作台：又称净化工作台，分为三类：侧流式、直流式和外流式。(2)无菌手术室：一般由三部分组成：更衣室、缓冲室和手术室。手术室配有净化工作台、二氧化碳培养箱、离心机、倒置显微镜等。缓冲室可以容纳冰箱、冰柜和消毒物品。(3)手术室：普通培养箱、离心机、水浴锅、固定时钟、普通天平和日常分析处理材料(4)清洗消毒间：烘箱、消毒锅、蒸馏水处理器、酸罐等。(5)分析室：显微镜、计算机、打印机等。3.培养皿常用的细胞培养容器包括培养瓶、培养板、培养皿等。通常制剂的量是使用量的三倍。容器应由透明、无毒、细胞粘附和生长材料制成，常用一次性聚苯乙烯材料产品或中性硬度玻璃产品。常用的器皿如下。(1)储液瓶：用于储存各种配制好的培养液、血清等液体。常见的规格有500毫升、250毫升、100毫升等。(2)培养瓶：根据培养细胞类型的要求，不同的培养瓶有不同的形状。用于细胞传代培养的细胞要求烧瓶壁厚均匀，这便于细胞贴壁生长和观察。瓶口尺寸应相同，口径一般不小于1厘米。允许吸管伸入烧瓶的任何部分，规格为200毫升、100毫升、50毫升、25毫升、10毫升等。(3)培养皿：用于开放培养和其他目的。它分为30毫米直径、60毫米直径、120毫米直径等。(4)稻草：常用长稻草和短稻草。长吸管也叫分级吸管。改进管的上部设有球形刻度改进吸管，刻度吸管用于(5)离心管：离心管是细胞培养中最广泛使用的容器。根据不同的用途，它有不同的形式。细胞培养中常用的离心管有两种：大腹式尖底离心管和普通尖底离心管。前者为50毫升、30毫升和15毫升；分别是。后者主要是10毫升和5毫升。(6)其他：如三角瓶、烧杯、量筒、漏斗、注射器等。4.细胞培养温度为了保持培养细胞的旺盛生长，必须有一个恒定和适当的温度。不同种类的细胞对培养温度也有不同的要求。人体细胞培养的标准温度为36.5和0.5。偏离这个温度范围会影响细胞的正常代谢，甚至导致死亡。培养细胞对低温的耐受性强于对高温的耐受性。当温度升至39以下时，细胞代谢与温度成正比。人体细胞在39-40下可以损伤1小时，但仍有可能恢复。在40-41下1小时，细胞一般会受到损伤，只有一小部分会恢复。在41-42下1小时，细胞严重受损，大多数细胞死亡，单个细胞仍有可能恢复。当温度高于431小时，所有细胞死亡。相反，当温度不低于0时，对细胞代谢有影响，但无有害影响。当细胞被放置在25-35时，细胞仍然可以存活和生长，但是速度减慢了。在4放置几个小时后，再回到37，细胞仍能继续生长。随着温度的降低，细胞代谢变慢。当温度降到冰点以下时，细胞会因细胞质结冰而死亡。然而，如果向培养液中加入一定量的冷冻保护剂(二甲基亚砜或甘油)，它可以在深低温下长时间储存，例如-80或-196(液氮)。5.合适的气体环境气体是哺乳动物细胞培养和存活的必要条件之一。所需气体主要包括氧气和二氧化碳。氧参与三羧酸循环，产生细胞生长和增殖所需的能量以及细胞生长合成所需的各种成分。在开放式培养中，细胞通常被置于95%空气和5%二氧化碳的混合气体环境中。二氧化碳不仅是细胞代谢产物，也是细胞生长和繁殖所需的成分。它在细胞培养中的主要功能是维持培养基的酸碱度。大多数细胞的适宜酸碱度为7.2-7.4，偏离这个范围将对细胞培养产生有害影响。然而，细胞的耐酸性高于耐碱性，这更有利于细胞在部分酸性环境中的生长。然而，一些细胞也喜欢在碱性环境中生长。例如，成纤维细胞最合适的酸碱度是7.4-7.6。每个细胞都有其最佳的酸碱值。细胞培养中无菌操作的基本技术无菌操作技术分为三个部分：工作环境和表面处理，细胞培养用玻璃和塑料制品处理，培养液和培养细胞处理。工作环境的处理层流洁净工作台是最经济有效的方法。洁净工作台正常工作时，向下的气流会阻止外界空气污染物进入超洁净工作台。(1)实验前，用紫外线照射无菌室和无菌手术台30-60分钟进行灭菌，用70%酒精擦拭无菌手术台，打开无菌手术台风扇10分钟后，即可开始实验操作。一次只处理一个细胞，以避免细胞交叉污染。实验结束后，将实验物品从工作台上拿出来。如果需要继续下一个实验，用70%的酒精擦拭无菌手术台，让无菌手术台的风扇运转10分钟，然后才能进行下一个实验。(2)无菌操作工作区应保持清洁和宽敞。必要的物品，如试管架、移液器或移液器，可以临时放置。其他实验项目使用后应及时拆除，以利于气体循环。实验物品在进入无菌操作台之前需要用70%的酒精擦拭。实验操作应在控制台中心的无菌区进行，而不是在边缘的非无菌区。(3)小心取出无菌实验用品，避免污染。不要碰它(4)工作人员应注意自身安全，实验前必须穿戴实验服和手套。应特别注意来自人类或病毒感染的细胞株，并应选择适当水平的无菌控制台(至少两个水平)。在操作过程中，应避免产生气溶胶，应小心处理有毒试剂，如二甲基亚砜和三聚氰胺，并应避免尖锐物体伤害人。(5)定期检查以下项目：CO2钢瓶内的CO2压力；CO2培养箱内的CO2浓度、温度和水盘是否被污染；无菌操作台的气流压力是否正常，定期更换紫外线灯管和HEPA过滤膜、预过滤网(300小时/预过滤网、30