无缝克隆,同源重组克隆

1.1.1 Gibson assembly简介（INTRODUCTION）原理：Gibson assembly是一种one step, one pot的快速基因组装方法。它只需要将基因片段和需要的三种酶混合在同一个管内在50C下培养15-60 min就可以得到组装好的DNA。 装配原理基于DNA片段间的重叠区域，过程依赖于三种酶：DNA 外切酶（T5 exonuclease）, 高保真DNA聚合酶。（Phusion polymerase）和耐热DNA连接酶 （Taq DNA ligase）的共同作用。首先，T5 核酸外切酶消化DNA片段的链 方向是从5到3. 每个DNA片段分别形成一个单链的突出部分，由于着这两个相邻的突出片段有一部分具有同源性能够互补，所以DNA片段退火，互补的序列重新配对连接。然后，在空缺的部分DNA聚合酶以另一条DNA单链为模板，沿3 方向将对应的脱氧核苷酸连接到单链上，填补缺口。最后，连接酶将两条DNA 单链黏合起来，密封裂缝。这样具有重叠区域的DNA片段就组装成一整条DNA分子了。下面是组装的示意图。材料（MATERIALS）r 试剂（REAGENTS）NAD，H2O ，1 M MgCl2，1 M DTT，10 mM dNTP mix，1 M Tris-HCl pH 7.5，50% PEG-8000，2.7 mg/ mL Tag ligase，0.85 g/ mL T5_ExO，Phusion(1)、LB培养基、抗生素（据载体而定）、LB平板（相应抗性）r 实验前准备（SETUP）于冰水浴中配制如下反应体系。如果不慎将液体粘在管壁，可通过短暂离心使其沉入管底。4x isothermal assembly bufferNAD 20 mgH2O 300 L1 M MgCl2 300 L1 M DTT 300 L10 mM dNTP mix 600 L1 M Tris-HCl pH 7.5 3 mL50% PEG-8000 3 mL加水到7.5 mL，每管分500 L存于-20C 或-80C冰箱,够3000个反应2 assembly mix: best combination:100 reaction 1 mL2.7 mg/ mL Tag ligase 10 L0.85 g/ mL T5_ExO 100 LPhusion(1 ) 25 L 4 G.A. buffer 500 L加水365 L，存于-20C冰箱，有效期1年。实验步骤（PROCEDURE）1. 设计引物通过PCR的方法在DNA片段的两端加上同源片段，NEB推荐同源片段的长度为15-40 bp，同时要求这部分对应的退火温度高于4C。2. 进行DNA纯化：PCR产物进行琼脂糖电泳，胶回收。或者PCR产物回收试剂盒回收。3. 进行重组反应，以20 L反应体系为例：组分 加入量Isothermal assembly Master Mix 10 L线性化载体 10-100 ng (1-2 L)插入片段 8-9 L (3-5载体)Sterilized ddH2O 补足至20 L50C反应15-60 min4. 反应产物转化、涂板及克隆鉴定同传统分子克隆方法。针对性建议1. 在选择克隆位点时，应避免选择克隆位点上下游50 bp内有重复序列的区域。当克隆位点上下游20 bp区域内GC含量均在40%60%范围之内时，重组效率将达到最大。如这部分区域GC含量高于70%或者低于30%，重组效率会受到较大影响。2. Gib