脂肪酶固定化方法的研究进展VIP

脂肪酶固定化方法的研究进展生物工程2班 周明 20091525摘 要：酶的固定化是生物技术中最为活跃的研究领域之一。脂肪酶能发生催化水解、醇解、酯化、酯交换等反应，是一种重要的生物催化剂。而由于脂肪酶的特性，其能否工业化利用很大程度取决于固定化技术的成功与否，酶的固定化方法是酶固定化技术的重要研究内容。固定化脂肪酶由于其易与底物分离且可重复使用而备受关注。为此，本文综述了常用的固定化方法，包括物理吸附法、共价结合法、交联法和包埋法，不同的固定化方法对酶的性质有不同的影响。本文对近年来固定化脂肪酶方法的研究进行了综述，为固定化方法的进一步探讨提供了研究基础。关键词：固定化；脂肪酶；载体材料The research progress of lipase immobilizedAbstract：Of enzyme fixed is in the biotechnology research field of the most active. Fat enzymes would happen catalytic water and alcohol, ester, ester exchange for is a major catalyst of biological. And the fat, the enzymes can be very much depends on the use of technology on the success of the enzyme is a fixed set of the technical content of important research. Into a fatty because of the enzymes that are and separate and can reuse have a major concern. The common immobilization methods were generally introduced including physical adsorption, covalent cross-linking method and entrapment method. Different immobilization methods had different effects on the enzyme. Of the few years, the enzymes a study of the review, as a further explore the method provides research.Keywords：immobilization; lipase; carrier脂肪酶（Lipase EC3.1.1.3，甘油酯水解酶）是一类特殊的酰基水解酶它的底物是油脂其水解部位是油脂中脂肪酸和甘油相连接的酯键1；人们对脂肪酶的研究已有上百年的历史 ，是最早被研究的酶类之一2。 脂肪酶作为生物催化剂，可用于许多有机合成反应，列如能在油水界面上催化酯水解或醇解、酯合成、酯交换、内酯合成、多肽合成、高聚物合成及立体异构体拆分等有机合成反应，是目前被重点研究的酯催化剂3。有关脂肪酶(1ipase)较确切的定义是20世纪70年代由 Brockerhoff等首先提出的，他将水解长链脂肪酸酯或水解油酸酯类的酶类定义为脂肪酶4。自由酶对所处环境十分敏感，在强酸、强碱、高温、高离子浓度和部分有机溶剂中均不够稳定，容易导致酶蛋白的变性，从而降低甚至丧失其催化活性。同时，自由酶反应后不易与底物和产物分离，既影响反应产物纯度又难以重复使用，这在很大程度上限制了酶促反应的广泛应用5。固定化酶(Immobilized enzyme)技术克服了自由酶的上述不足，提高了酶的储存稳定性，实现了重复使用及连续自动化生产，降低了成本，在生物工程、食品工业、医药和精细化学工业等领域有着广泛的应用前景。酶大分子包含疏水头和亲水尾两部分酶的反应部位与疏水头不同位，但很靠近，亲水尾使酶分子在界面上的定向更为稳定。因此，酶在界面上具有较大的亲和力，脂肪酶催化作用需要一定的水份必须水，以维持酶分子的活性构象，这些必须水与酶分子的带电基团相互作用，使酶分子具有一定的柔韧性而表现出催化活力。脂肪酶的固定化方法 大致分为4类：吸附法、共价法、交联法和包埋法。分析和比较了各种固定化方法。1固定化脂肪酶的方法1.1吸附法吸附法包括物理吸附和离子吸附。物理吸附是最简单的固定化方法，利用离子键或吸附作用将酶固定到载体上，操作相对简单，很少用到有机试剂。主要依靠蛋白质和载体间的结合力联结，作用力较弱，酶易脱落但载体选择范围较广，固定化操作过程简单，吸附法是经济上最具吸引力的固定化方法。高阳6等以不同大孔树脂吸附法固定化假丝酵母99125脂肪酶，在微水有机相中的应用表明，非极性树脂NKA是最佳的固定化载体。结果表明，在给酶量为1.92/1 （初始酶粉与树脂的质量比），pH为7.4，体系水含量为15%（水与油的质量比），反应温度为40条件下，固定化酶具有最佳的催化能力。固定化酶连续反应19批以后，生物柴油的转化率仍然保持为70.2%，固定化酶的酶活为初始值的85.1%，显示出固定化酶具有良好的操作稳定性。 王冰7等以沙蒿多糖壳聚糖复合磁性微球为载体，采用物理吸附法固定化脂肪酶，对固定化过程中对酶活力有影响的各种因素进行研究，同时对固定化酶的部分理化性质、最适pH 、最适温度、酶的热稳定性以及表观米氏常数与游离酶做了比较。实验结果表明：固定化脂肪酶的最佳条件为每0.1g载体加2%(w/v)的酶溶液0.9mL，固定8h，温度为50。固定化酶的Km小于游离酶的Km，其最适pH和最适温度分别为8.0和50.而且固定化脂肪酶具有良好的热稳定性、可应用性和重复使用性。李俊奎8等以纺织物膜为载体, 通过吸附法对Candida sp.99-125脂肪酶发酵液固定化处理。系统地研究了以提取的毛油和甲醇为原料，用固定化Candida sp. 99-125 脂肪酶催化合成脂肪酸甲酯(FAMEs)的可行性。同时考察了磷脂对固定化酶活性、反应起始速率、固定化酶使用批次的影响以及毛油和精炼油对固定化酶使用批次等的影响。研究结果表明，用磷脂质量分数为1%的石油醚悬液浸泡过的脂肪酶比仅用石油醚浸泡过的脂肪酶初始转酯化速率显著下降。说明磷脂可以造成固定化酶的失活，这与Yomi Watanabe的结论相符；当磷脂的质量分数为 0%5%时, 5 min 和 15 min 的产率都随着磷脂质量分数的增大而减少，当磷脂的质量分数在 5%15%时，5 min和15 min产率变化不明显；大豆油和小桐子油两种油料的毛油、脱胶油和精炼油对酶的寿命影响不明显，两种毛油经过10个批次FAMEs的产率还保持70%以上。1.2包埋法包埋法是一种酶物理包埋在高聚物内，反应条件温和，很少改变酶结构的固定化方法。其基本原理是单体和酶溶液混合，再借助引发剂进行聚合反应，将酶固定于载体材料的网格中9。适用于大多酶、酶制剂及完整的微生物细胞，但只有小分子的底物和产物条件下适用。包埋法包括凝胶包埋法和微囊化法。王爱玲10等以海藻酸钠明胶为复合载体，采用包埋法制备固定化黑曲霉脂肪酶，考察了海藻酸钠、明胶浓度等因子对固定化效果的影响，比较固定化酶和游离酶对温度、 等条件的稳定性。结果表明，制备固定化黑曲霉脂肪酶的最优条件为：海藻酸钠、明胶浓度分别为1.25%和0.5%，CaCl2浓度为10%，给酶量为450U/g ，固定化酶最适温度为35，最适pH为9.0。鲁玉侠11等研究了以海藻酸钠为载体，用包埋法制备固定化脂肪酶的条件，将一定量的海藻酸钠用蒸馏水加热溶解，在海藻酸钠浓度为1条件下，与一定量的酶液混合均匀，逐滴分别加到 0.01mol/L、0.03mol/L、0.05mol/L、0.07mol/L、0.09mol/L 的 CaCl2 溶液中。结果表明，CaCl2浓度为0.03mol/L时，酶活力最大。将500mg脂肪酶溶解在 pH=6 的缓冲溶液中，然后两者混合均匀，用注射器将海藻酸钠酶液逐滴到 1%的无菌 CaCl2溶液中，搅拌条件下室温固定1h，过滤，洗涤，干燥，得球状固定化脂肪酶。试验表明，此固定化酶具有良好的耐热性能，在 60下加热固定化脂肪酶和游离脂肪酶1.5h，固定化酶活力仅损失30%，而游离脂肪酶的酶活只为原来的18%。固定化脂肪酶还有良好的可操作性，连续使用反应10次，固定化脂肪酶的酶活依然为初始酶活的95%。1.3交联法主要特色是用多功能试剂进行酶蛋白分子之间的交联，基本原理是酶分子和多功能试剂之间形成共价键，得到三向的交联网架结构。通常在载体上加入氨基、醛基等功能性集团来使酶结合得更牢固。最常用的交联试剂是戊二醛，此类方法是固定化酶研究中最有潜力的方法。刘新喜12等用蛋壳作载体固定化脂肪酶，其工艺条件为：酶用量为0.12U/g ，搅拌吸附时间为30min，在pH为6.2的室温下，先将酶吸附在蛋壳的表面，再用戊二醛试剂进行交联。得到固定化酶的最大活力29.41 U/g，该固定化酶最适用的温度为35，最适pH为9.0，重复使用6次后活力仍保留53%。胡文静13等以化学改性后的壳聚糖为载体固定假丝酵母99125脂肪酶，研究了用活化后壳聚糖为载体，采用与戊二醛偶联。结果表明载体的活EDC的量为20mg，活化时间为20min，交联剂浓度为0.15%，交联时间为60min，pH为7.4时，固定化酶的活力最大。一般地固定化效率与固定化酶的活力的变化趋势一致，但是在优化交联剂用量的过程中，固定化效率随着交联剂用量的增大而增大，这是因为当戊二醛浓度为0.15%时，载体表面的氨基组分得到充分的交联，从而酶与载体得到最大的结合量。1.4共价结合法彭立凤14等研究了以纤维素滤纸膜为载体的猪胰脂肪酶的四种固定方法（高碘酸钠氧化法、对苯醌活化法、环氧氯丙烷活化法、壳聚糖涂层法），再用戊二醛活化法在纤维素滤纸上固定化猪胰脂肪酶的方法，并对之进行了比较。结果表明，在适宜条件下，高碘酸钠氧化法获得的固定化酶活最高，达0.52U/cm2，酶活回收率为20%。曹国民15 等研究了蚕丝固定化脂肪酶的工艺条件，并考察了固定化脂肪酶的稳定性。试验结果表明：蚕丝与对硫酸醋乙矾基苯胺(SESA)反应制备蚕ABSE-蚕丝，再与脂肪酶进行共价偶联，制得活力为106160U/g的固定化脂肪酶，此时固定化酶的活力回收率较高。固定化酶的稳定性较高，其操作半衰期约为250h。2.展望脂肪酶在食品、洗涤剂、制药等方面应用广泛，但是，当前脂肪酶的用量占工业用总酶量不足3，且大多数被用于洗涤剂和皮革等工业中16。由于固定化酶的制备方法过于复杂，效率低、成本高，以及化学试剂的使用易使酶活力降低或失活等因素的制约，固定化酶在工业生产中的应用受到限制。寻找廉价、易于活化和制备的载体是脂肪酶固定化发展的一个方向，另外，游离脂肪酶在催化反应进行中酶分离困难；酶在非水溶液中不溶解；脂肪酶催化反应的底物油脂不溶于水等缺点，因此难以实现工业化应用。为此，许多研究者展开了对脂肪酶进行固定化的研究 ，寻找解决脂肪酶的工业化应用 问题 。 同时，固定化技术一直也是学术界和工业界的接触点和共同热点。对于其它方面的应用，还需更多人的研究，来开发红曲的应用潜力，让红曲更多更好地为人类服务。参考文献1 邢旺兴，张梅，方琅等中药红曲的药理作用研究进展J药学实践杂志，2006,24（1）：1-32 陈秀琳.脂肪酶固定化的研究概况J.海峡药学，2007,19（12）：114-116.3 高贵，韩四平，王智等硅藻土固定化脂肪酶吉林大学学报(理学 版 )，2002，40(3)：324-3264 李秋生，余若黔，杨博固定化脂肪酶的应用研究进展四川食品与发酵2003-035 杨勇，李彦锋等酶固定化技术用载体材料的研究进展化学通报20076 高阳，谭天伟等大子树脂固定化脂肪酶及在微水相中催化合成生物柴油的研究生 物工程学报20067 王冰,王云普等沙蒿胶磁性微球固定化脂肪酶及部分理化性质的研究食品工业科技20088 李俊奎,鲁吉珂固定化脂肪酶催化毛油合成生物柴油生物工程学报2009,69