脂质体转染的实验原理与操作步骤大全

脂质体转染的实验原理和操作步骤细胞转染的方法主要有电穿孔法、显微注射法、基因枪法、磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法、各种阳离子物质介导法、病毒介导法等。理想的细胞转染方法具有转染效率高、对细胞毒性小等优点。本文主要介绍细胞转染中常用的脂质体转染的原理和操作步骤。脂质体试剂是阳离子脂质体n-1-2，3-二醇，丙基-n，n，n-三甲铵氯化物(dotma)和二油酰photeye-thanolamine(DOOTE)1:1(w/w)的混合物。它适用于将DNA转染到悬浮或单层培养细胞中，并且是当前条件下最方便的转染方法之一。转染率高，比磷酸钙法高5-100倍，可将脱氧核糖核酸和核糖核酸转染到各种细胞中。当用LR转染时，应首先优化转染条件，并应找出这批LR转染特定细胞的合适剂量和作用时间。对于每一批细胞受体，首先要确定一个DNA的数量和DNA/细胞受体混合物与细胞的相互作用时间。从15g开始培养，培养时间为6小时。应根据这两个参数画出相应左后所需剂量的曲线。然后，选择合适的细胞因子和DNA的剂量来确定转染时间(224小时)。由于LR对细胞有一定毒性，转染时间不应超过24小时。细胞类型：COS-7、BHK、NIH3T3、Hela、Jurkat等细胞可用作受体细胞。一、脂质体转染法的原理脂质体转染法的原理：脂质体作为体内和体外递送的载体，已经被广泛研究。涂有合成阳离子脂质的脱氧核糖核酸也可以融合到人类细胞中。与其他方法相比，脂质体在携带不同类型的人真核细胞的DNA方面具有更高的效率和更好的重复性。中性脂质体利用脂质膜包裹DNA，并利用脂质膜将DNA导入细胞膜。对于带正电荷的阳离子脂质体，DNA不是预先包埋在脂质体中，而是带负电荷的DNA自动结合到带正电荷的脂质体上形成DNA-阳离子脂质体复合物，该复合物被吸附到带负电荷的细胞膜表面并通过胞吞作用引入细胞。二、脂质体转染操作步骤1.操作步骤方法1:(1)细胞培养：取6孔培养板(或用35mm培养皿)，每孔加入2mL 1-2105细胞培养液，在37CO2下培养至40%-60%融合(过度融合不利于转染后的细胞筛选)。(2)转染液的制备：在聚苯乙烯管中制备以下两种溶液(用于转染每个孔细胞的量):1-10 g用无血清培养基稀释的DNA，最终量为100L，和溶液B:用无血清培养基稀释的2-50gLR，最终量为100L，轻轻混合溶液A和溶液B，并在室温下放置10-15分钟。稍后会出现轻微浑浊，但不会妨碍转染(如果沉淀可能是由LR或DNA浓度过高引起的，应适当降低)。(3)转染制备：用2mL无血清培养液冲洗两次，然后加入1mL无血清培养液。(4)转染：将A/B化合物缓慢加入培养液中，摇匀，置于37培养箱中6-24小时，吸出无血清转染液，换成正常培养液继续培养。(5)观察、筛选和检测等其他处理与其他转染方法相同。注意：转染时不要添加血清，血清对转染效率有很大影响。2.快速脂质体转染方法的操作步骤如下：方法2:(1)用6孔板(或35mm培养皿)接种5105细胞/孔24小时，使其达到板底部面积的50-60%。(2)试管内制备DNA/脂质体复合物方法如下：在1毫升无血清DMEM中稀释PSV2-新质粒DNA或供体DNA。旋转1秒钟，然后加入脂质体混悬液并旋转。(3)在室温下放置5-10分钟，使DNA与脂质体结合。(3)弃去细胞内的旧液，用1毫升无血清DMEM清洗细胞一次，弃去，直接在每孔中加入1毫升DNA/脂质体复合物，在37培养3-5小时。(4)向每个孔中加入20 DMEM，继续培养14-24小时，(5)吸出DMEM/脱氧核糖核酸3.稳定的脂质体转染方法如下：(1)在接种细胞之前，细胞生长至板底部面积的50%，并可用于转染。(2)从与步骤(2)和(3)相同的DNA/脂质体复合物制备转染细胞。(3)向每个孔中加入1毫升和20 DMEM，在37培养48小时。(4)吸出DMEM，用G418选择培养液稀释细胞，让细胞生长一定时间，筛选转染的克隆。该方法按照细胞克隆筛选方法进行。三、个人经历：1.转染前一天，将0.5-2105个细胞接种在24孔培养板上，并加入500微升不含抗生素的完整培养基，以确保细胞在转染过程中聚集到90-95%。2.准备复合材料(1)将0.8微克的脱氧核糖核酸稀释在50微升无血清和无抗生素的培养液中，并轻轻混合。(2)将2ul脂质体转染胺2000稀释于50ul无血清和无抗生素培养液中，轻轻混合，并在室温下孵育5分钟。注意：必须在25分钟内完成。(3)5分钟后，将它们混合，轻轻混合，并在室温下孵育20分钟。3.从培养皿中取出培养基，用PBS或无血清培养基洗涤细胞两次(最好)。4.将化合物(总体积：100微升)加入培养孔中，来回摇动培养板，使其均匀分布。5.将细胞置于培养箱中培养4 6小时后，可更换含血清的培养液以去除复合物(或不去除)。6、24 48h后可观察到转移基因的表达。7.稳定转染：更换含血清培养基后24小时，细胞以110(或更高)的比例传代，1天后更换筛选培养基进行筛选。8.优化：保证小区收敛率达到90 95%(相对较高)；DNA/脂质体2000的比例为10.5 15，平均细胞比例为1