基因工程的基本操作程序-PPT课件

-,1,专题1基因工程,-,2,1.DNA的分子结构,基本组成元素：,CHONP,基本组成物质：,基本结构单位：,4种脱氧核糖核苷酸,脱氧核糖+含氮碱基+磷酸,一级结构：,脱氧核苷酸链,空间结构：,DNA双螺旋结构,DNA分子的结构,腺嘌呤脱氧核糖核苷酸（A）,鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸（G）,胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸（T）,胞嘧啶脱氧核糖核苷酸（C）,2.DNA双螺旋结构特点,一个DNA含有两条多核苷酸链，多核苷酸链是由很多个核苷酸聚合而成；两条多核苷酸链反向平行；脱氧核糖与磷酸交替连接，形成DNA分子多核苷酸链的骨架，排列在外侧，碱基排列在内测；DNA分子两条链上的碱基，遵循一定的规律形成碱基对，碱基对之间通过氢键连接。,-,3,DNA分子的平面结构,氢键,-,4,A,A,T,T,G,C,C,T,T,A,A,G,-,5,基础知识梳理,一、基因的概念、载体及功能,-,6,基础知识梳理,3染色体、DNA、基因的数目关系(1)一般来说，每条染色体上含一个DNA分子。(2)每个DNA分子上有很多个基因。(3)每个基因中又含有成百上千个。,脱氧核苷酸,-,7,一、有关概念间的相互关系1脱氧核苷酸、基因、DNA、染色体之间的关系,-,8,基础知识梳理,二、基因控制蛋白质的合成1合成过程,-,9,一、基因工程诞生的基础,20世纪中叶，基础理论取得了重大突破1.DNA是遗传物质的证明2.DNA双螺旋结构和中心法则的确立3.遗传密码的破译,-,10,技术发明使基因工程的实施成为可能：1.基因转移载体的发现2.工具酶的发现3.DNA合成和测序技术的发明4.DNA体外重组的实现5.重组DNA表达实验的成功6.第一例转基因动物问世7.PCR技术的发明,-,11,基础知识梳理,四、中心法则,-,12,基因工程又叫基因拼接技术或DNA重组技术。该技术是在生物体外，通过对DNA分子进行人工“剪切”和“拼接”，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞内进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生出人类所需要的生物类型和生物产品。,二、基因工程的概念,基因拼接技术或DNA重组技术,生物体外,基因,DNA分子水平,人类需要的生物类型和生物产品,剪切,拼接,导入,表达,基因重组,-,13,基本工具：限制性核酸内切酶“分子手术刀”DNA连接酶“分子缝合针”基因进入受体细胞的载体“分子运输车”,三、DNA重组技术的基本工具,-,14,1.基因的剪刀限制性内切酶（简称限制酶）,限制酶是在生物体(主要是微生物)内的一种酶，能将外来的DNA切断，由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶。特点：特异性。即一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子。,-,15,基因的剪刀限制性内切酶（简称限制酶）,限制酶,-,16,什么叫黏性末端？,被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。,-,17,-,18,当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，产生的是平末端。,当限制酶从识别序列的中心轴线两侧切开时，产生的是黏性末端。,-,19,识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。(6个,4、5、8个),主要是从微生物中分离纯化出来的一种酶。,4000种。,（1）来源：,（2）种类：,（3）作用：,（4）结果：,形成两种末端,限制性核酸内切酶“分子手术刀”（小结）,-,20,要想获得某个目的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？一个目的基因有几个黏性末端？,要切两个切口，产生四个黏性末端，两个（首尾）。,如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？,会产生相同的黏性末端。,是不是把两者的黏性末端黏合起来，这样就真的合成重组的DNA分子了?,实际还不够,还需要DNA连接酶进行连接。,思考题：,-,21,1、种类：2、作用部位：,磷酸二酯键,DNA连接酶可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，即把梯子两边扶手的断口连接起来，这样一个重组的DNA分子就形成了。,2.DNA连接酶“分子缝合针”,-,22,A,A,T,T,G,C,C,T,T,A,A,G,-,23,3.基因进入受体细胞的运载体“分子运输车”,（1）运载体的作用,作为运载工具，将外源基因(抗虫基因)转移到受体细胞(棉花细胞)中去。利用运载体在受体细胞(棉花细胞)内，对外源基因(抗虫基因)进行大量复制。（随载体的复制而复制）,（2）作为运载体必须具备的条件,能够在宿主细胞中自我复制并稳定地保存。具有一个或多个限制酶切点，以便与外源基因连接。具有某些标记基因，便于进行筛选。必需是安全的，不会对受体细胞有害。大小应适合，便于提取和操作,-,24,（3）常用的运载体,基因进入受体细胞的运载体“分子运输车”,细菌细胞质的质粒噬菌体的衍生物动植物病毒,注意：真正用作运载体的质粒都是人工改造过的。,-,25,最常用的质粒是大肠杆菌的质粒，其中常含有抗药基因，如四环素的标记基因。质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性作用，但复制只能在宿主细胞内成。,质粒是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，并且具有自我复制能力的双链环状DNA分子。,质粒是基因工程最常用的运载体。,-,26,四、基因工程基本操作的四个步骤,1、目的基因的获取,2、基因表达载体的构建,3、将目的基因导入受体细胞,4、目的基因的检测与鉴定,-,27,目的基因的获取,1、目的基因主要是指_,编码蛋白质的结构基因，是人们所需要转移或改造的基因。如苏云金芽孢杆菌的抗虫基因，还有植物的抗病（抗病毒、抗细菌）基因、种子贮藏蛋白的基因，以及人的胰岛素基因、干扰素基因等。,2、获取目的基因的常用方法有哪些?,（1）从基因文库中获取,（2）利用PCR技术扩增,（3）人工合成,请阅读P9第一和二两段,-,28,（一）从基因文库中获取目的基因,将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库,基因文库,-,29,基因组文库与部分基因文库的关系,怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因呢?,-,30,基因文库的构建方法,鸟枪法：,供体细胞中的DNA,许多DNA片段,运载体,限制酶,与载体连接载入,受体细胞,产生特定性状,导入,外源DNA扩增,目的基因,分离,(直接分离法),-,31,反转录法：以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。,目的基因的mRNA,单链DNA,反转录酶,DNA聚合酶,双链DNA(目的基因),-,32,根据已知的氨基酸序列合成DNA法：,根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,结构基因的核苷酸序列,推测,推测,目的基因,化学合成,-,33,上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？,操作简便广泛使用,工作量大，盲目，分离出来的有时并非一个基因,专一性强,操作过程麻烦，mRNA很不稳定，要求的技术条件较高,专一性最强,仅限于合成核苷酸对较少的简单基因,-,34,概念：PCR全称为_，是一项在生物_复制_的核酸合成技术,条件：_、_、_、_.,原理：_,方式：以_方式扩增，即_（n为扩增循环的次数）,结果：,聚合酶链式反应,体外,特定DNA片段,DNA复制,已知基因的核苷酸序列,四种脱氧核苷酸,一对引物,DNA聚合酶,指数,2n,使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增,(二)利用PCR技术扩增目的基因,-,35,-,36,过程：,a、DNA变性（90-95）：双链DNA模板在热作用下，_断裂，形成_,b、退火（复性55-65）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部_。,c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，从引物的5端3端延伸，合成与模板互补的_。,氢键,单链DNA,双链,DNA链,-,37,1.用一定的_切割质粒，使其出现一个切口，露出_。2.用_切断目的基因，使其产生_。,基因表达载体的构建核心,3.将切下的目的基因片段插入质粒的_处，再加入适量_，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）,限制酶,黏性末端,同一种限制酶,的黏性末端,切口,DNA连接酶,相同,-,38,质粒,DNA分子,限制酶处理,一个切口两个黏性末端,两个切口获得目的基因,DNA连接酶,重组DNA分子（重组质粒）,同一种,4.过程:,-,39,5.基因表达载体的组成：,复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因,-,40,基因表达载体的构建基因工程的核心,目的：所需物质：,使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。,它们各自的作用是什么?,启动子+目的基因+终止子+标记基因,-,41,常用的受体细胞：,有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。,将目的基因导入受体细胞的原理,借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。,目的基因导入受体细胞,-,42,将目的基因导入受体细胞,转化,方法,将目的基因导入植物细胞,将目的基因导入动物细胞,将目的基因导入微生物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法,感受态细胞,目的基因进入_内，并且在受体细胞内维持_和_的过程,受体细胞,稳定,表达,-,43,1、将目的基因导入植物细胞的方法：农杆菌转化法（1）农杆菌介绍：（2）原理及适用范围,-,44,2、将目的基因导入动物细胞（1）方法：显微注射法（2）程序：,3、将目的基因导入微生物细胞（1）原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少（2）方法：,目的基因表达载体提纯取卵（受精卵）显微注射受精卵新性状动物,用Ca2+处理细胞感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子,-,45,目的基因的检测与鉴定,检查是否成功,检测,鉴定,检测转基因生物染色体的DNA