生物大分子分离纯化-原理与技术.ppt

生物大分子分离纯化原理与技术,内容提要,1、层析原理与技术2、凝胶过滤层析3、UNOsphere离子交换分离技术4、CHT陶瓷羟基磷灰石分离技术5、疏水相互作用与亲和层析,Lifeisbasedonproteinsandtheirinteractions,层析原理与操作,层析的起源和原理,起源-1906年，俄国植物学家Tsweet原理-利用物质分配系数不同达到分离目的,原理与操作,Chromatography,层析,色谱,什么是生物层析,根据生物分子物理化学特性的不同而达到分离极性：polarity(solubility,volatility)HIC,RP离子特性：ioniccharacteristics(charge)IEX大小与形状：size/mass(diffusion,sedimentation)GF结构特征与活性位点：shape(ligandbinding,affinity)AC这些特性的区别使不同蛋白质分子在层析的固定相和流动相的分配不同而达到分离,原理与操作,GelFiltration凝胶过滤,IonExchange离子交换,HydrophobicInteraction疏水层析反相,Affinity亲和层析,CHT羟基磷灰石,原理与操作,最广泛的蛋白质分离纯化方法条件温和维持蛋白质空间结构与活性基于蛋白质对固定相的不同保留达到分离蛋白质溶于流动相中，经过装填固定相的柱子分离,层析原理与操作,层析的5个操作步骤,装柱并平衡上样平衡洗脱再生,上样,装填有层析介质的层析柱,分离,分离组分流出,原理与操作,层析图,原理与操作,第一峰,外水体积,Vo,不与柱中填料相互作用直接从柱中流出。这是样品中的未结合物质,Vo,Ve,Vt,蛋白质含量(A280),由UV检测器读出，y轴,基线,洗脱峰，有些可以很好的分离，有些分得不是很好，有部分交叉,有时这里也显示梯度浓度等检测值,时间或体积，x轴,纯化平台的硬件结构层析工作站层析介质和层析柱,原理与操作,层析系统,DuoFlow中高压层析系统,LP低压层析系统,Profinia全自动亲和层析系统,手动层析组件,DuoFlow中高压层析系统,主要特点：3500psi高压力下梯度模式最大流速可达20ml/min连续波长，4波长同步检测方形X、Y轴组分收集器软件直观容易使用,BioLogicLP低压层析系统,LPDataView软件,BioLogicLP系统,BioFrac方形组分收集器,主要特点：流速精确，0.01ml/min检测灵敏度更高,0.001AU兼容方形收集器,Profinia蛋白质纯化系统,主要特点：全自动亲和纯化，包括亲和标签、亲和无标签，抗体等纯化双紫外检测器设计纯化与脱盐串联一步完成结果直接报告目标蛋白的浓度和得率,为什么在层析技术中要使用层析仪,介质的要求实验的精密度和重现性要求时间的要求,纯化平台的硬件结构,层析介质与层析柱，原理与技术,层析介质,离子交换层析介质UnosphereQ，SMacroPrepHighQ,HighS,DEAE,CM亲和层析ProfinityIMAC金属螯合介质ProfinityEpoxide环氧亲和介质Affi-GelProteinA,Affi-PrepProteinAAffi-Gel蓝胶，DEAE蓝胶，CM蓝胶Affi-Prep多粘菌素介质Affi-Gel硼胶Affi-Gel配体固定化活化介质,凝胶过滤层析介质Bio-GelP系列Bio-BeadsS-X介质羟基磷灰石介质（CHT）氟代羟基磷灰石介质（CFT）疏水层析介质Macro-PrepMethylHICMacro-Prept-ButylHICBio-BeadsSM-2吸附剂,层析柱,分析柱离子交换分析柱：UnoQ,SAminex分析柱分析单糖、寡糖、有机酸、有机碱，以及肽和核酸有机小分子羟基磷灰石分析柱：Bio-ScaleCHT-I凝胶过滤分析柱：Bio-Sil,Bio-SilectHPLC分析柱反相层析分析柱：Hi-PoreRP304,Hi-PoreRP318,各种层析介质的Cartridges用于条件摸索UNOsphereMacroPrepCHTHIC,层析介质结构原理,UnosphereMacroPrep,离子交换层析Q，S，DEAE，CM,疏水层析-CH3,t-Butyl,亲和层析ProteinAIDANi多粘菌素,凝胶过滤CHT和CFT,UnosphereQ,SMacroPrepHighQ,SMacroPrepDEAE,CM,MacroPrepMethylHICMacroPrept-ButylHIC,ProfinityIMACProfinityEpoxideAffi-GelProteinA,Affi-PrepProteinAAffi-Gel,DEAE,CMAffi-PrepPolymixinAffi-Gel硼胶Affi-Gel配体固定化活化,层析介质及其技术,凝胶过滤层析离子交换层析羟基磷灰石层析疏水层析亲和层析,1.Sphericalparticlespackedintoacolumn,2.Sampleapplied,3.Buffermobilephaseandsamplemovethroughcolumn,moleculesdiffuseinandoutofmatrix,4.largemoleculesleavethecolumnfirstfollowedbysmallermoleculesinorderofsize,moleculeslargerthanthematrixporespassstraightthrough.,凝胶过滤,凝胶过滤层析,分离纯化原理,Agoodgelforgelfiltrationcontainsabout95%water,凝胶结构,Stericexclusionleadstoearlyelution,按照分子量大小洗脱大分子首先洗脱，最小的分子在最后面洗脱,1001,00010,000100,000Bio-GelP2Bio-GelP4Bio-GelP6Bio-GelP10Bio-GelP30Bio-GelP60Bio-GelP100,1,800,800,4,000,1,000,6,000，用于脱盐,1,500,20,000,2,500,40,000,3,000,60,000,5,000,100,000,100,凝胶过滤层析,凝胶的选择,Bio-GelP4(800-4,000)forseparationdigestedproductsfromIgG,凝胶过滤层析,凝胶的选择,凝胶过滤层析,Bio-GelP6(1000-6000),凝胶的选择,凝胶过滤层析,Bio-GelP10(1500-20,000),凝胶的选择,凝胶过滤层析,Bio-ScaleMiniBio-GelP6脱盐预装柱,操作方便，可连接在DuoFlow、LP、Profinia和Econo泵上,Bio-BeadsS-X介质多孔的聚苯乙烯二乙烯微球体,Bio-BeadsS-X1,Bio-BeadsS-X3,600,Bio-BeadsS-X8,1,000,Bio-BeadsS-X12,400,高分辨率亲脂性分子排阻色谱,2,000,14,000,中草药和天然产物活性成分分离纯化高分辨率，快速纯化酯类、芳香族，多环、杂环化合物,介质可兼容苯、甲苯、二甲苯、四氯化碳、二甲基甲酰胺、酮、二氯甲烷、二氯代苯、全氯乙烯等有机溶剂,凝胶过滤层析,1、三硬脂酸甘油酯，8912、三肉豆蔻酸甘油酯，7293、三月桂酸甘油酯，6454、三辛酸甘油酯，4775、三己酸甘油酯，3936、十六烷，2267、十一烷，156,Bio-BeadsS-X8分离效果,高分辨率亲脂性分子排阻色谱Bio-BeadsS-X介质,凝胶过滤层析,柱长的选择分离：30120cm脱盐：30cm以下洗脱液离子强度,pH中性流速，根据层析介质的说明，一般很低样品容量：13CV,凝胶过滤层析,操作参数选择,增加分辨率的方法,检测柱效检测分离度减少上样体积降低流速使用更小的介质颗粒的介质连接2根层析柱,1.可分离相对分子量从几百到几十万的物质具有3000个理论塔板的凝胶过滤可将分子量相差2倍的蛋白质完全分开,6000个理论塔板的可将分子量相差1.5倍的蛋白质完全分开;建议柱高在80-120cm,直径=H/302.脱盐,凝胶过滤层析,凝胶过滤层析的应用,凝胶过滤层析,凝胶过滤层析的特点：,层析柱规模很大，实验室1.0-2.530-100cm，工艺1020200cm，从而设备成本很高；上样体积少，必须少于柱床体积的3才能达到较好的分离效果，如果大体积样品必须浓缩，从而造成样品的损失和增大工艺的复杂性；工艺时间（生产周期）长，甚至24小时或以上；分辨率低；不需摸索纯化条件，按照分子量区带分离,因此，往往用分子筛分离时只适用于纯化的最后一步去热原，或离子交换上样前的脱盐,离子交换层析,离子交换层析类型及其选择,-O-CH2CH2-NH+,C2H5,C2H5,-N+(CH3)3,-O-CH2-C-O-,O,-SO3-,pI,stabilityrange,stabilityrange,与阳离子交换介质结合,+,-,denaturation,denaturation,pH,10,2,离子交换层析,离子交换层析原理蛋白质滴定曲线,蛋白质净电荷,与阴离子交换介质结合,Products:UNOsphereQ&S,Macro-PrepHighQ&S,CM,DEAE,AGresins,Equilibration,SampleApplication,SampleAdsorption,Elution,Regeneration,离子交换层析,离子交换层析原理,sampleapplicationandwash,elution,equilibration,regeneration,-,-,-,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,anionexchangerbead,离子交换过程,离子强度洗脱时多采用离子浓度梯度,常加NaCl,KCl,LiCl等.在不同盐浓度（离子强度）及其不同变化率（梯度）条件下保留行为不同，需对该条件进行摸索。一般的，随离子强度增加，蛋白质保留值减小。,缓冲液与pH选择适当的缓冲体系，起始浓度要尽可能低些(0.01-0.05M)缓冲液PH值：阳离子低于pI一个pH单位以上阴离子通常高于pI一个pH单位以上蛋白质在不同pH下保留行为差别较大，所以许对缓冲体系和操作pH进行摸索，以得到最佳层析条件。,离子交换层析,离子交换层析操作参数选择,pI5.5,+,-,pH,10,2,离子交换层析,缓冲液与pH,pI7.5,阳离子交换,阴离子交换,碱性蛋白，采用阳离子交换,酸性蛋白，采用阴离子交换,蛋白质净电荷,pH4.0,pH9.0,蛋白质稳定性范围,pH7.0,pH8.0,pH8.9,pH6.0,缓冲液与pH的影响阴离子交换,离子交换层析,离子交换层析操作参数选择,离子交换层析,离子交换层析操作参数选择,盐溶液梯度的影响,ColumnsMediaBio-ScaleMiniHighQMacro-PrephighQBio-ScaleMiniHighDEAEMacro-PrepDEAEBio-ScaleMiniHighSMacro-PrephighSBio-ScaleMiniUNOsphereQMacro-PrepCMBio-ScaleMiniUNOsphereSMacro-Prep25QBio-ScaleMiniUNOsphererapidSMacro-Prep25SUNOQUNOsphereQUNOSUNOsphereSUNOsphererapidS,离子交换层析,离子交换层析产品,50um,25um,120um,80um,10um,100um,更高的选择性和分辨率10%穿透载量:UnosphereQ:150mg/mlBSA600cm/hrUnosphereS:30mg/mlBIgG600cm/hr高流速，低反压操作压力:1week长期:Storagein0.1MNaOHRTfor1year生产效率大大提高,离子交换层析,UNOsphereQ/S性能参数,Column1.1x20cmLoadbuffer:20mMTris,pH8.5ElutionBuffer:Load+0.5NaClLoad:5mg/mlBSA,Column1.1x20cmLoadbuffer:20mMNaAc,pH5.0ElutionBuffer:Load+0.5NaClLoad:1.64mg/mlhIgG,UNOsphereQ:BSA,UNOsphereS:HIgG,高流速，高载量：Unosphere,高流速，低反压：Unosphere,离子交换层析,UNOsphere更高的生产效率：,更短的工艺时间短时间内处理大量体积样品更小的层析柱，更少的介质更高的产量更短的生产周期生产成本下降,离子交换层析,蛋白质纯化，特别是从原材料或发酵中间体目标蛋白的大量捕获中间纯化,UNOsphereQ/S应用,4ProcessSteps1.Polymerization2.Washing3.Deagg/Sizing4.BaseTreatment,MonomerCross-linkerIonomerSurfactantSaltSolventInitiatorHeat,UNOsphere制造过程,UNOsphere,%cross-linker:S25%Q25%,离子交换层析,UNOsphereQ/S结构,Continuousnetworkofpolymernodules0.5-1m,Channels3-5m,Q：(CH3)3N+S：SO3-,ProfinityIMAC：IDA-Ni，Cu，Co,离子交换层析,UNOsphereQ/S结构,Reference:T.Ogawaet.al.HydroxyapatiteConference2001,陶瓷羟基磷灰石（CHT）分离技术,合成,左边:Bio-GelHT/HTP羟基磷灰石右边:CFT/CHTTM陶瓷羟基磷灰石I&II,晶体与陶瓷结构,陶瓷羟基磷灰石（CHT）分离技术,Ca10(PO4)6(OH)25个带正电荷的Ca离子对（C位点）2个磷酸三价离子，每个含有带6个负电荷的氧原子（P位点）2个羟基于其他层析介质不同，CHT的骨架是化学反应的表面,CHT陶瓷羟基磷灰石晶体结构,陶瓷羟基磷灰石（CHT）分离技术,产品类型与参数,陶瓷羟基磷灰石（CHT）分离技术,蛋白质带正电氨基经典的阳离子交换用中性盐溶液(NaCl)或缓冲盐溶液(PO4)洗脱,初级保留机制,陶瓷羟基磷灰石（CHT）分离技术,带负电羧基经典的金属螯合作用，并受离子排阻调节比离子间静电相互作用强1560倍在无PO4条件下不能被任何浓度NaCl洗脱用PO4洗脱,初级保留机制,陶瓷羟基磷灰石（CHT）分离技术,大部分大分子蛋白质以两种保留机制联合模式结合：Ca亲和与阳离子交换酸性蛋白质的结合，如白蛋白（albumin）以钙亲和作用为主，阳离子交换仅有轻微的作用，这意味着NaCl对白蛋白载量和保留的影响是非常有限的。碱性蛋白质，如IgG以阳离子交换作用为主，其载量和保留受NaCl影响显著,注：对于带负电荷的酸性蛋白质，无论样品是否含有NaCl，都对上样时的吸附载量和保留无影响，这意味着可以将捕获阶段获得的中间体样品无需脱盐处理即可上样到CHT上进行高分辨率中间纯化,混合保留机制,陶瓷羟基磷灰石（CHT）分离技术,Equlibrate:5mMNaPO4pH6.5Gradient:5mM300mMNaPO4,Eq:5mMPO4,0.3MNaClpH6.5Grad:5mM300mMPO4,0.3MNaCl,IgGMAb,BSA,混合保留机制,陶瓷羟基磷灰石（CHT）分离技术,单克隆抗体，多克隆抗体纯化重组疫苗抗体片段重组蛋白质酶核酸:DNA/RNA(单双链)膜蛋白质,羟基磷灰石应用,陶瓷羟基磷灰石（CHT）分离技术,优点独特的分离机制高再生能力高分辨率容易规模放大容易进行方法开发高机械稳定性高化学稳定性层析柱寿命长易于将HT工艺直接转移到CHT/CFT上CFT比CHT更耐酸,颗粒大小：20um、40um和80um,陶瓷羟基磷灰石（CHT）分离技术,TypeI由于具有更高的表面积，I型具有更高的蛋白载量，而且具有更大的保留.TypeII由于具有大孔结构，II型具有更高的核酸载量，能分离单链和双链DNA，和超螺旋与非超螺旋的DNA白蛋白不能与II型结合，对于一些含白蛋白的抗体样品，II型分离纯化更有利.大分子重组疫苗的中间纯化和大规模制备,如何选择类型,陶瓷羟基磷灰石（CHT）分离技术,CHT纯化或去除DNA的机理,陶瓷羟基磷灰石（CHT）分离技术,分离纯化原理与操作参数选择,羟基磷灰石（CHT）,影响蛋白质色谱行为的操作参数：CHT类型NaCl浓度PB缓冲液浓度梯度双梯度洗脱PB缓冲液梯度含不同NaCl浓度缓冲液pH值,双梯度洗脱模型先以0-500mMNaCl，再以0-500mM磷酸钾,不同类型CHT陶瓷羟基磷灰石在不同pH下不同蛋白质的保留时间（min）,羟基磷灰石（CHT）,不同蛋白质分离纯化的Protocol：IgG,羟基磷灰石（CHT）,不同蛋白质分离纯化的Protocol：球形蛋白质，质粒,羟基磷灰石（CHT）,不同蛋白质分离纯化的Protocol：酸性蛋白质,羟基磷灰石（CHT）,双梯度洗脱,羟基磷灰石（CHT）,0-0.5MNaCl,0-0.4MNaPO4,玉米种子中纯化转基因抗体IgG,图1CHT-I柱纯化1-AT。柱尺寸：752mm(10ml)；上样量：5.0ml；BufferA：10mM磷酸钠缓冲液（pH7.0）；BufferB：400mM磷酸钠缓冲液（pH7.0）；梯度：0-5%B和5-30%B各5个柱体积，30-100%B10个柱体积；流速：2.5ml/min。分部收集组分为1.5ml，收集如下：收集组分I-VIII分别为：运行组分（图上方轴）12-17、23-24、42-49、49-50、51-53、54-58、69-71和74-77。绿条框指示为1-AT洗脱液。,CHT纯化转基因羊奶中的重组人1-抗胰蛋白酶,羟基磷灰石（CHT）,PI,其中，1-AT，pI5.27乳白蛋白，pI5.16-乳球蛋白,pI=4.77,5.274.775.16,Markettrendoftherapeuticantibodies,Twentyapprovedantibodytherapeuticscurrentlyavailableforthetreatmentofvariousdiseases-Reopro,Rituxan,Herceptin,Remicade,Synagis,Avastin,Erbitux,Xolair,Raptiva,Lucentis,Tysabri,etc.Theantibodytherapeuticsmarketisexpectedtogrowbyabout30%annuallyreachingexcessof$22billionby2007.Reference:AntibodyTherapeutics:ProteinDevelopment,MarketTrends,andStrategicIssues,Revisededition,ProductionofMonoclonals,FermentationHarvest,Recovery,DownstreamProcessing,BulkDrugSubstance,MonoclonalsDownstreamProcessAGenericApproach,Criticalcontaminantsindownstreamprocessdevelopment,Retentionofaggregates,AggregatestendtobindCHTmorestronglythan“monomeric”IgG.ThisindicatesthatthebindingcharacteristicsoftheindividualIgGmoleculesinanaggregateareadditive.Thelargertheaggregate,thestrongerthebinding.AggregateremovalinNaClgradientsatlowconcentrationsofphosphategenerallyprovidesevenbetterseparationthansizeexclusionchromatography,athigherflowrates,andmuchhighercapacity.,TheeffectofpHonaggregateseparation,15mM,10mM,pH7.5,pH6.5,Sodiumchloridegradientatconstant5mMNaPO4,1.5MNaCl,0.5MPO4,proteinApurifiedIgGonCHTtypeI20m,TheeffectofPO4onaggregateseparation,1MNaCl,0.5MPO4,15mM,10mM,25mMPO4,Indicatedphosphateconcentrationmaintainedacrossthesodiumchloridegradient,proteinApurifiedIgGonCHTtypeI20m,DOEtoOptimizeResolutionofAggregates,ContourplotofpHandPO4onaggregateresolution,Resolutionfactor=2tB-tA/(WA+WB)wheretandWcorrespondtotheretentiontimeandpeakwidthatbaselinerespectively.Reference:PKNget.al.JournalofChromatographyA,1142(2007)13-18,AnalysisofCHTfractions,HPSECofCHTfractionsBio-Silect400-550Lsample,0.8mL/min50mMHEPES,1.0MNaCl,2Murea,pH7.2,CHTpoolfrom0.5MPO4cleaning,NativeIgGpoolfromNaClgradient,IgGpoolfromproteinA,NativeIgGElutionZone,RetentionofproteinA,Theelutionzonesforfree*proteinAandfreeIgGoverlaptovaryingdegrees.HoweveritisimportanttorememberthatproteinAisnot“free”undermostconditions:itisaffinity-complexedwithIgG.AswithIgGaggregates,thebindingcharacteristicsofIgGandproteinAareapparentlyadditiveinthecomplex.WhenelutionisconductedwithNaClataconstantlowconcentrationofphosphate,proteinA-IgGcomplexeselutemuchlaterandwellseparatedfromfreeIgG.ProteinA-IgGcomplexeselutemostlyinthe0.5MNaPO4cleaningstep.Greaterthan90%reductionispossibleinasinglestep.,RetentionoffreeproteinAvsIgG,PhosphategradientelutionatdifferentconcentrationsofNaCl,CHT,typeI,40mGreenproteinA,GrayIgG,0.0MNaCl,0.3MNaCl,RetentionoffreeproteinAvsIgG,NaClgradientelutionatdifferentphosphateconcentrations,CHT,typeI,20mGreenproteinA,GrayIgG,5mMPO4,20mM,10mM,RetentionofDNA,ThebindingofDNAisdominatedbymetalaffinitywithCHTcalcium.Thisalsoappliestootherphosphorylatedcontaminantssuchasendotoxins.Phosphateconcentrationsof200400mMarerequiredforelution.WhenIgGiselutedinaNaClgradientatlowphosphateconcentration,DNAreductionofmorethan3logsispossible.Endotoxinreductionunderthesameconditionsismorethan4logs.,RetentionofDNAonCHT,+0.50MNaCl,+1.0MNaCl,0.80MPO4,+0.25MNaCl,10mMPO4,+0.00MNaCl,ShearedsalmonspermDNACHTtypeI,40micron,600cm/hr,pH7.0,RetentionofDNA/RNAonCHT,RemovalofvirusesacrossCHT,Retentionofendotoxins,Endotoxinsarehighlyacidicduetoahighcontentofphosphorylandcarboxylresidues.BothshouldhavestrongaffinityforCHTcalcium.Elutionintheabsenceofphosphateshouldnotoccur.SomeendotoxinshaveaminogroupswhichmaycationexchangewithCHTphosphatesatlowionicstrength.Endotoxinsoccurinarangeofaggregationstates,intothemillionsofDaltons.MostofthechargesareinternalizedbecauseoftheirassociationwiththehydrophobiclipidAregion.Bothsizeandchargeshieldingmayaffectretention.Endotoxinsarefrequentlycomplexedwithproteinsandothercellwallcomponentsthatmayalsoinfluenceretention,Removalofhostcellproteins(HCP),HCPareuniqueforeachcellline.HundredstothousandsofHCPsderivedfromcellorcelldebrisarepresentinfermentorfluid.BulkofHCPsisremovedacrossproteinAchromatography.MixedmodeinteractionwithCHTcanofferuniqueopportunityforremovalofresidualHCPs.,TheeffectofNaClandphosphateonCHOPclearance,CHTfractionationofcontaminants,ProteinA-purifiedhumanIgG1CHTtypeI,20micron,300cm/hr,20mMNaPO4,pH6.540CVlineargradientto1MNaCl(20mMPO4)Cleanwith0.5MNaPO4,Monomer,Aggregate(tetramer),dnaetoxpa,Largeraggregates,2-StepPlatformPurification,proteinA/CHT,EluteproteinAwith0.1Mglycine*orarginine*0.05MNaCl,pH3.8(nocitrateorEDTA).Holdforviralinactivation.RaisepHto6.5byadditionof0.5MNaPO4pH10.5,1%v:v.EquilibrateCHTto5mMNaPO4,pH6.5RunoptimizedCHTfractionationconditions*Glycineandarginineconcentrationcanberaisedto1-2Mtoreduceaggregation.,2-Stepplatform(ChimericIgG),Case1,OMPPAPCHTAggregate%IgG-40Br-NO3-ClO4-I-SCN-Cations:Mg2+Li+Na+K+NH4+蛋白质以高浓度盐溶液结合与疏水层析柱上，以低浓度盐溶液洗脱,原理,疏水层析,MacroPrepMethylHICMacroPrept-ButylHIC,产品,疏水层析,生物分子表面大都有或强或弱的疏水区域，在不同环境下，与各种疏水介质产生不同强弱的结合高离子强度可加强疏水性跟离子交换相反，高盐吸附，低盐洗脱；洗脱样品又可直接或稍加稀释后加上其他层析柱，作为连接层析步骤的桥梁，取代盐析沉淀技术比反相层析的配体密度低很多，无须有机溶剂洗脱，保存生物活性配体种类繁多，很难预测哪一种、哪一个条件最适合，可用疏水层析试盒选择介质,作用原理,溶质,曝露在外的疏水基,配基,水分子,大量水分子,DG=DH-TDS,为什么使用疏水层析?,离子交换技术、羟基磷灰石、凝胶过滤技术、亲和层析技术的补充温和，非变性条件纯化互补的选择性高收率浓缩技术,操作参数选择,疏水层析,疏水介质选择：甲基，丁基，苯基疏水疏水性强的蛋白质：甲基，丁基疏水性弱的蛋白质：丁基，苯基盐：硫酸铵，醋酸铵等等缓冲体系和pH洗脱梯度,Sample:GFPsamplebroughtupto2MAS,filteredLoad:5mlBuffer:A:2M(NH4)2SO4+0.1MNaP,pH7B:0.1MNaP,pH7FlowRate:3ml/min(230cm/hr),Macro-Prep甲