边做边学以尿素为唯一氮源的土壤微生物的分离、培养与数量测定.pptx

分离土壤中能分解尿素的微生物,生物技术实践无菌操作技术实践,授课：蓝益添2019年5月16日,课题背景,尿素及尿素的利用,尿素是一种重要的农业氮肥，但不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。,细菌能利用尿素的原因：,土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶,课题目的,1.从土壤中分离出能够分解尿素的细菌；2.统计每克土壤样品中含有多少这样的细菌。,研究思路,实例启示,筛选菌株,PCR技术利用的是耐高温的DNA聚合酶。科学家是从水生耐热细菌Taq中分离到耐高温的TaqDNA聚合酶的。Taq细菌是美国微生物学家于1966年在美国黄石国家公园的一个热泉（7080）中发现的。,为什么Taq细菌能从热泉中筛选出来？这给我们什么启示？,研究思路,筛选菌株原理,人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。,思考与讨论,根据细菌利用尿素的原理，讨论本课题使用的培养基配方。,1.选择什么物质提供碳源？2.选择什么物质提供氮源？3.培养基的物理状态是什么？,筛选原理,绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但只有合成脲酶的微生物才能分解尿素。,唯一氮源,允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，叫做选择培养基。,思考与讨论,如何证明该培养基具有选择作用？,以尿素为唯一氮源的培养基,牛肉膏蛋白胨培养基,是,实验组,对照组,培养基类型,是否接种,结果,只生长分解尿素的细菌,生长多种微生物,是,思考与讨论,通过上述选择培养基筛选得到的微生物一定是目标菌种吗？,思考：在培养微生物的过程中，培养基中的氮源是否发生变化？,研究思路,鉴定菌株,如何对初步筛选得到的菌株进行鉴定？,研究思路,鉴定菌株,资料：已知在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素分解成氨。氨会使培养基的碱性增强，pH值升高。,请根据以上信息，你会如何鉴定筛选到的菌株？,在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂（鉴别培养基），对初步分离的菌株进行培养。如果指示剂变红，说明该菌种能够分解尿素。,研究思路,统计菌落数目,1.显微镜直接计数：,利用血球计数板(血细胞计数板），在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。,不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；个体小的细菌在显微镜下难以观察；,缺点：,研究思路,统计菌落数目,2.间接计数法（活菌计数法）,原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。,方法：稀释涂布平板法,研究思路,统计菌落数目,为保证结果准确，一般选择菌落数在30-300的平板进行计数。,结果评价,两位同学用稀释涂布平板法测定同一个土壤样品的细菌数，在相应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。1.第一位同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。2.第二位同学在该浓度下涂布了三个平板，统计的菌落数为21、212和256，该同学以三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。,1.你认为哪位同学的结果更接近真实值？2.对于两位同学的实验结果，你认为该如何改进？对此你有何启示？,2.间接计数法（活菌计数法）,设置重复组：在设计实验时，一定要涂布至少3个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性。,在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误，需要重新实验。,每克样品中的菌株数,(CV)M,其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。,2.间接计数法（活菌计数法）,当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。故统计的菌落数往往比活菌的实际数目偏_。,误差分析：,低,结果评价,在实验时，A同学从对应106倍稀释液中筛选出大约150个菌落，但其他同学在同样的稀释倍数下只选择出大约50个菌落。1.你认为A同学得出此数据的原因有哪些？2.应该如何验证你的想法？,假设1：土样不同。,由其他同学用与A同学相同土样进行实验，如果结果与A同学一致，则证明A同学无误；如果结果不同，则证明假设不成立,结果评价,在实验时，A同学从对应106倍稀释液中筛选出大约150个菌落，但其他同学在同样的稀释倍数下只选择出大约50个菌落。1.你认为A同学得出此数据的原因有哪些？2.应该如何验证你的想法？,假设2：培养基污染或操作失误。,将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。,实验设计,设置对照,设置对照的主要目的是排出实验组中非测试