食品微生物检验用样品抽样方法及应用3.21.pptx

食品微生物检验用样品的抽样方法及应用品质研发部,目录食品抽样检测的概念和目的食品抽样检测的意义我国及国际食品和饲料微生物抽样依据抽样方案（二级、三级计数抽样方案流程）微生物检验抽样、制样操作原则生产和加工环境的微生物采样空气采样与测试方法-沉降法,食品抽样检测的概念和目的,抽样抽取样品或组样的程序。基于统计方法的抽样程序用于对检验批作出判断。（可接收性抽样：从某批中选择一个或多个样品进行检验,根据样品检验结果对该批予以接受或者不接受。）目的：有代表性的，能客观、真实地反映整批产品的卫生质量。,如果样品的采取、运送、保存或制备过程中操作不当，或者样品不具有代表性，就会使实验室的微生物检验结果毫无意义。微生物检验采样的核心要求：1保证样品的代表性和一致性2保证整个微生物检验过程在无菌操作条件下完成,食品抽样检测的意义,1.及时掌握食品及原料的过程卫生状况（食品采购、生产加工、储存运输、销售消费等）2.评价食品卫生质量3.用于寻找及分析问题，制定和实施控制措施抽样检测足够量的样品以获得同一批次产品的有意义的信息。一个合理的抽样计划并不能保证健康危害完全不发生。,抽样检验的局限,低水平污染的微生物检出概率低微生物分布的不均匀性对检出概率有影响不均匀性未知受检验方法的质量限制,我国食品和饲料微生物抽样依据,国家标准（GB,GB/T）农业部行业标准（绿色食品，无公害食品等）（NY，NY/T）检验检疫行业标准（SN，SN/T）地方标准（DB）,国际食品和饲料微生物抽样依据,国际食品微生物标准委员会(InternationalCommitteeonMicrobiologicalSpecificationforFoods,ICMSF)（ICMSF方法是从统计学角度来考虑，对一批产品检查多少个检样才能够有代表性，才能客观地反映该批产品质量的设想采样的。）美国食品药品管理局(USAFDA)美国农业部(USDA)欧盟委员会法令(EC)新西兰食品安全局(NZFSA)澳大利亚检验检疫局(AQIS),抽样方案,抽样方案不是孤立存在的，它应与产品卫生标准和方法标准等充分衔接，才能更有效。,卫生标准,抽样方案,检验方法,食品安全目标FSO,ICMSF的采样方案:ICMSF方法中包括二级法及三级法2种。二级法只设有n、c及m值，三级法则有n、c、m及M值。n：指一批产品的采样个数。c：指该批产品中检样菌数超过限量的检样个数。m：指合格菌数限量。M：指附加条件后判定为合格的菌数限量。在中等或严重危害的情况下使用二级抽样方案，对健康危害低的则建议使用三级抽样方案。,ICMSF提出的采样基本原则，是根据以下考虑来规定不同的采样数:(1)各种微生物本身对人的危害程度各有不同；(2)食品经不同条件处理后，其危害程度可分为3种情况：危害度降低；危害度未变；危害度增加。ICMSF是将微生物的危害度、食品的特性及处理条件三者综合在一起进行食品中微生物危害度分类的。这个设想是很科学的，符合实际情况的，对生产厂及消费者来说都是比较合理的。,抽样方案的选择,广泛分布于食品中，具有严重危害或者中度健康危害的微生物（病原菌），如沙门氏菌、志贺氏菌、致病性大肠埃希氏菌、肉毒梭菌、单核细胞增生李斯特菌等执行二级计数抽样方案（+/-）,没有或者具低度危害的微生物（卫生指标菌），或者具有中度危害（扩散限制）的微生物，如需氧微生物、嗜冷微生物、乳酸菌、酵母菌、霉菌（产犊霉菌除外）、大肠菌群、耐热大肠菌群等执行三级计数抽样方案（数值和浓度）,主要采用二级取样方案：中国、以色列、日本、美国、南非、古巴等。主要采用三级取样方案：中国、智利、新西兰、欧洲委员会、加拿大、芬兰、丹麦、法国、澳大利亚等。从标准的严格程度看，二级取样方案比三级取样方案要求更严格。二级取样方案的合格判定标准只有“是”和“否”，没有中间带，而三级取样方案则有中间带，相对宽松，这也表明三级取样方案更注重各种微生物本身对人的危害程度，从风险评估的角度看，也更科学一些。从标准的制定来看，三级取样方案判定合格标准的制定更需建立在科学评估的基础上，手续更加繁琐，而且在实际应用中操作较复杂；而二级取样方案在实际操作中则相对简单。,二级计数抽样方案流程,目标微生物以检出/未检出（+/-）为指标：设定m值、n值和c值抽取n个子样，组成试验样品检验每个子样所有样品的检验结果m,或c个样品的检验结果m，接收该批次c个样品的检验结果m，拒绝接收该批次,二级法：只设定合格判定标准m值，超过m值的，则为不合格品。通过检查在检样中是否有超过m值的，来判定该批是否合格。如生食鱼片中细菌总数标准为n=5，c=0，m=100cfu/g。其中m=100cfu/g即为限量标准，n=5即取样5个，c=0即表示在该批5个检样中，若未见有超过m值为100cfu/g的检样，则该批产品为合格品。cfu：colonyformingunit,菌落形成单位,举例,三级计数抽样方案流程,目标微生物以计数为指标：设定m值、M值、n值和c值抽取n个子样，组成试验样品检验每个子样所有样品的检验结果m，或c个样品的检验结果介于m和M之间；接收该批次c个样品的检验结果介于m和M之间，或所有样品的检验结果M；拒绝接收该批次,三级法：设有微生物标准值m及M值，如同二级法，超过m值的检样为该检样不合格。所有检样均小于m值，该批产品为合格；在m值到M值范围内的检样数在c值范围内，即为附加条件合格，否则为不合格；凡有检样超过M值者，则该批产品为不合格。如澳大利亚冷冻糖制食品的大肠菌群标准为n=5，c=2，m=100，M=1000，其含义是从一批产品中，取5个检样，若所有检样大肠菌群结果均小于m=100，则判定为该批产品合格；若2个检样的结果位于m与M值之间(即1001000之间)，则判定为附加条件合格；若有3个及以上检样的结果位于m与M值之间，判定为该批产品不合格；若有任一检样大肠菌群数超过M值(即1000)者，则判定该批产品不合格。,举例,涉及健康危害水平的抽样方案及其应用条件ICMSF,举例1,巴氏灭菌的液态、冷冻、干燥鸡蛋制品的抽样方案（ICSMF，1986）,GB2749-2003蛋制品卫生标准,采用二级和三级取样方案的食品安全国家标准2010,GB5420干酪GB11674乳清粉和乳清蛋白粉GB19302发酵乳GB19644乳粉GB19645巴氏杀菌乳GB25191调制乳GB25192再制干酪GB13102炼乳GB19646稀奶油、奶油和无水奶油2010-12-01实施,GB10765婴儿配方食品GB10767较大婴幼儿和幼儿配方食品GB10769婴儿谷物类辅助食品2011-04-11实施（GB19301生乳2010-06-01实施，未采用二级或三级取样方案）,GB4789.1-2010食品微生物学检验总则,4.2采样方案4.2.1类型采样方案分为二级和三级采样方案。二级采样方案设有n、c和m值，三级采样方案设有n、c、m和M值。n：同一批次产品应采集的样品件数；c：最大可允许超出m值的样品数；m：微生物指标可接受水平的限量值；M：微生物指标的最高安全限量值。注1：按照二级采样方案设定的指标，在n个样品中，允许有c个样品其相应微生物指标检验值大于m值。注2：按照三级采样方案设定的指标，在n个样品中，允许全部样品中相应微生物指标检验值小于或等于m值；允许有c个样品其相应微生物指标检验值在m值和M值之间；不允许有样品相应微生物指标检验值大于M值。,GB4789.1-2010,例如：n=5，c=2，m=100CFU/g，M=1000CFU/g。含义是从一批产品中采集5个样品，若5个样品的检验结果均小于或等于m值（100CFU/g），则这种情况是允许的；若2个样品的结果（X）位于m值和M值之间（100CFU/g1000CFU/g），则这种情况也是不允许的。4.2.2各类食品的采样方案按相应产品标准中的规定执行。,制样的一般要求,全部制备过程应为无菌操作冷冻样品应在规定温度和时间下缓化制样应充分均匀：液体样品振摇混匀；粉末状的边取边混；固体样品应从不同部位取样，兼顾表面和深度。缩分干燥的颗粒状及粉末状样品，最好使用圆锥四分法。圆锥四分法是把样品充分混合后堆砌成圆锥体，再把圆锥体压成扁平的圆形，中心划两条垂直交叉的直线，分成对称的四等份，弃去对角的两个四分之一圆，再混合，反复用四分法缩分，直到留下合适的数量作为“检验样品”。取好的样品应以适宜方式与稀释液充分混匀尽量去除产品中可能存在的影响微生物指标检测的因素,对取样工具和一些试剂材料应提前准备、灭菌开启容器的工具：双层纸包裹灭菌（121，15min）后，通常可在干燥洁净的环境中保存2个月。超过2个月后要重新灭菌。样品采集工具。取样容器：采用密封容器，最好不要使用玻璃容器，因为其在运输途中易破碎而造成取样失败。温度计、标记工具、防护用品等。,样品采集、运输和贮存：运输工具的容量应足以放下所取的样品。采样及运输过程符合要求的时间和温度，防止污染和变质。预处理、分析检验：适宜环境、正确的制样和测试方法（依据相应的检验标准）,微生物检验抽、制样操作原则,防污染防止抽样、制样及检测的各个环节引入外源污染；或使样品污染人员及环境。均匀与合理尽量了解目标微生物在产品中的浓度和分布，兼顾检样的代表性和偶然性。,生产和加工环境的微生物采样,“环境”与产品接触表面或其他可能存在的污染环节，如生产加工设备和材料、加工环境和操作人员。卫生标准操作程序(SSOP)中的“食品接触表面”生产环境与环节中的间接接触,“环境接触表面”如空气气溶胶，地板，排水渠，墙壁，高架结构，设备，围裙，卡车或汽车轮子。,此类采样监测一般不宜复检，结果适用于加工环境卫生状况的趋势性分析、评估与控制。对某一致病菌的环境监测采样同样适用，需要参考致病菌检测的具体方法要求。,擦拭法原理,选定一定范围的产品接触表面/环境，用干或湿的棉签进行擦拭，然后将棉签浸入灭菌稀释液或中和液的容器中，混匀后进行检测。,擦拭法图示,材料与器具,样品采集工具：单独包装的灭菌的棉签、海绵、纱棉垫等。海绵和纱棉垫用于100cm2的表面采样。取样工具必须符合无菌要求。取样容器：灭菌的瓶或袋，试管及其他类似的密闭容器。最好不要使用玻璃容器。消毒剂：75%酒精或其他有类似效果的食品级消毒剂。,稀释液：灭菌的缓冲蛋白胨水（0.1%，PH7.5）或含盐蛋白胨水以及其他适当的稀释液（如M肉汤、LB肉汤、D/E中和肉汤、脑心浸液肉汤等）。标记工具样品运输工具：便携式冰箱或保温箱。使用保温箱或替代容器（泡沫塑料箱）时，应将足够量的冷冻冰袋放在容器的四周，以保证运输过程中样品容器的温度。防护用品：经消毒灭菌的工作服、工作帽、口罩、雨鞋、手套等。,操作步骤,棉签采样：(1)台面：取出棉签，在含稀释液的管中润湿，在管壁上挤去多余的水分。手捏棉签棒，用棉签头在选定的区域（20cm2-100cm2）内用力擦拭。具体的方式是先水平再垂直地移动，并转动棉签，使其所有面都用到。折断或切除手接触部分棉签棒，将棉签头放入含稀释液的试管内，密闭。,棉签采样：(2)人手:取出棉签，在含稀释液的管中润湿，在管壁上挤去多余的水分。请被检人五指并拢，用棉签在右手指曲面，从指尖到指端来回涂擦10次，折断或切除手接触部分棉签棒，将棉签头放入含稀释液的试管内，密闭。,结果表达,计数初始稀释液中每毫升的菌落数，然后按公式计算每平方厘米接触面上的菌落数（Ns）。NFNs=DA其中N为1mL稀释液（或中和液）中的菌落数；F为试管或均质袋内稀释液（或中和液）的总体积，以mL表示；A为被测接触面的面积，以cm2表示；D为稀释倍数。,样品传递,采集完毕的样品应保存在1-4的保温箱中，并在4h内送达检测实验室。实验室应在24h内进行检测。,空气采样与测试方法-1沉降法,样