课题2　多聚酶链式反应扩增DNA片段.pptx

聚合酶链式反应,PCR:PolymeraseChainReaction,浠水一中陈旭,学习目标,生命观念科学思维,通过比较细胞内DNA复制和体外复制的相同点和不同点，能够运用结构与功能观、物质与能量观，阐明PCR的反应条件、基本原理和反应过程,科学思维科学探究,通过学习PCR技术的产生和发展历史，能够体会演绎推理和创造性思维在科学研究发现中的重要作用,重难点,PCR技术,多聚酶链式反应（polymerasechainreaction，PCR）是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，它能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。这项技术有效地解决了因为样品中DNA含量太低而难以对样品进行分析研究的问题，被广泛地应用于遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和DNA序列测定等各方面。,内容,条件,细胞内的DNA复制需要哪些条件？,解旋酶、DNA聚合酶等,DNA的两条链,4种脱氧核苷酸,？,酶（催化解旋、聚合等）,模板,能量,DNA复制,作用,细胞内的DNA复制需要哪些条件？,解旋酶+能量,DNA母链,DNA聚合酶,4种脱氧核苷酸(dNTP),dNTP,引物,打开DNA双链,做为模板,催化合成DNA子链,合成子链的原料,提供聚合反应所需的能量,？,？,作为体外模拟DNA复制的PCR技术，是如何模拟的呢？,DNA复制,解旋酶+能量,DNA母链,DNA聚合酶,4种脱氧核苷酸(dNTP),小段RNA，由引物酶合成,PCR,加热（9095）,DNA母链,耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）,4种脱氧核苷酸(dNTP),小段DNA，一般由化学法人工合成,作用,打开DNA双链,做为模板,催化合成DNA子链,作为原料及供能,作为引物,?,?,?,PCR是对DNA复制的体外模拟,PCR技术发展简史,PCR技术发展简史,50-65退火,XX延伸,95（变性）,55（复性/退火）,37(延伸),这是个劳动密集型的工作，不仅繁琐，而且昂贵,使PCR真正广泛应用的，是耐高温的DNA聚合酶的使用,我国台湾的科学家钱嘉韵第一个报道分离出了耐高温DNA聚合酶1973年，钱嘉韵在美国辛辛那提大学生物系时，首次从美国黄石公园热泉里的嗜热菌Taq菌中分离了耐高温的TaqDNA聚合酶，并于1976年发表这一成果。,TaqDNA聚合酶（thermusaquaticus),酶活性(%),温度(),405060708090100,10080604020,热泉的高温条件淘汰了绝大多数微生物，而使耐热的Taq菌脱颖而出。高温条件选择了Taq菌，Taq菌选择了耐热的Taq酶。,问题：为什么能够很快从热泉中的Taq菌里发现耐热的DNA聚合酶呢？为什么大肠杆菌里没有耐热的DNA聚合酶？,95（变性）,55（复性/退火）,72(延伸),1986年春，Mullis首次提出耐高温酶的使用；同年6月，Cetus公司首度将Taq酶应用于PCR，大获成功1988年，第一台PCR仪（即热循环仪）问世1993年穆利斯PCR获得诺贝尔化学奖,PCR的基本反应步骤,变性95C,延伸72C,退火55C,2535轮,预变性95C,5min,DNA复制,解旋酶+能量,DNA母链,DNA聚合酶,4种脱氧核苷酸(dNTP),小段RNA，由引物酶合成,PCR,加热（9095）,DNA母链,耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）,4种脱氧核苷酸(dNTP),小段DNA，一般由化学法人工合成,作用,打开DNA双链,做为模板,催化合成DNA子链,作为原料及供能,作为引物,?,PCR是对DNA复制的体外模拟,PCR反应演示,PCR知识总结,PCR六要素：模板引物dNTP耐热DNA聚合酶（Taq酶）缓冲液（含Mg2+）热循环装置（PCR仪）,PCR知识总结,PCR的实质,体外模拟的DNA复制,PCR的产物,两条引物之间的DNA片段,PCR的过程,预变性,变性,复性（退火）,延伸,当堂训练,1、下列符合PCR反应条件的是（）稳定的缓冲液环境DNA模板合成引物四种脱氧核苷酸DNA聚合酶DNA解旋酶限制性内切酶温控设备A.B.C.D.,当堂训练,2、PCR过程与细胞内的DNA复制过程相比，主要有两点不同，它们是（）PCR过程需要的引物是人工合成的单链DNA或RNA；PCR过程不需要DNA聚合酶；PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的；PCR过程中，DNA不需要解旋，直接以双链DNA为模板进行复制A.B.C.D.,当堂训练,3、PCR是一种体外快速扩增DNA的方法，用于放大特定的DNA片段，数小时内可使目的基因片段扩增到数百万个。PCR需要模板DNA、引物、脱氧核苷酸和DNA聚合酶等条件。下图为模板DNA分子及2种引物，请回答相关问题。(1)PCR的全称是_。RCR与体内DNA复制的不同之处主要表现在温度环境的不同，在PCR技术中先用95高温处理的目的是_，而这一过程在细胞内是通过_实现的。(2)在PCR技术中所需要的引物实质上是一种_。请在图中绘出引物结合的位置。(3)DNA子链复制的方向是_，这是由于DNA聚合酶只能_。(4)若将1个DNA分子拷贝10次，则需要在缓冲液中至少加入_个引物。,聚合酶链式反应,使DNA变性,解旋酶的催化,单链DNA或RNA分子,211-2,从5端到3端,从引物的3端开始连接单个脱氧核苷酸分子,课下练习,1、PCR扩增过程中，一共会出现几种长度的单链（不包括引物）？2、若以一个DNA分子为模板开始PCR，在第几轮结束时开始出现目的片段？第n轮结束时，目的片段有多少个？3、若以一条DNA单链为模板开始PCR，在第几轮结束时开始出现目的片段？第n轮结束时，目的片段有多少个？,谢谢！,dNTP,dNTP是脱氧核糖核苷（三磷）酸的缩写，是包括dATP、dGTP、dTTP、dCTP在内的统称，N是指含氮碱基，代表A、T、G、C、U等中的一种。dNTP是细胞内DNA合成的原料。,ATP与dATP,dATP,ATP与dATP,dATP,什么是引物？为什么DNA合成需要引物呢？,这源于DNA的分子结构以及DNA聚合酶的两个特性,1、DNA双螺旋的两条单链是反向平行的,DNA单链与肽链一样，两个末端结构是不一样的,3端：游离羟基,5端：游离磷酸基团,3端：游离羟基,母链,子链,5端,5端,3端,3端,2、DNA聚合酶具有两个特性,只能向子链的3端加上游离的脱氧核苷酸，使子链的3端延长,而无法反向聚合不能从头开始合成DNA，只能从3端延伸DNA链,3端：游离羟基,5端：游离磷酸基团,3端：游离羟基,母链,子链,2、DNA聚合酶具有两个特性,只能向子链的3端加上游离的脱