快速筛选一抗二抗原则PPT演示课件

一抗、二抗的选择,1,5、常用抗体供应商筛选,4、二抗的选择,3、一抗的选择,1、抗原基础知识概述,2、抗体基础知识概述,2,抗原基础知识概述,3,抗原基础知识概述,抗原(antigen)：是指一种能刺激人或动物机体产生抗体或致敏淋巴细胞，并能与这些产物在体内或体外发生特异性反应的物质。打个比方：抗原一般是侵入机体的病原微生物或者机体病变的、非正常的成分，是侵略者。,4,抗原基础知识概述,抗原包括免疫原性和反应原性。免疫原性又称为抗原性，是指能够刺激机体形成特异抗体或致敏淋巴细胞的能力。反应原性是指能与由它刺激所产生的抗体或致敏淋巴细胞发生特异性反应。抗原的基本性质具有异物性、大分子性和特异性。,5,抗体基础知识概述,6,抗体是机体免疫细胞被抗原激活后，由分化成熟的终末B细胞识别抗原后增殖分化为浆细胞所产生的一种蛋白质，主要存在于血清等体液中，能与相应抗原发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。打个比方：抗体是对付抗原的防御力量。因为有侵略者的入侵，才有抵抗侵略者的防御力量。免疫球蛋白（Ig），可分为分泌型（sIg）和膜结合型（mIg）两类，抗体都是免疫球蛋白（Ig），并非所有免疫球蛋白都具有抗体活性。,抗体基础知识概述,7,抗体的结构Ig分子的基本结构是由四肽链组成的。即：由二条相同的分子量较小的肽链(轻链)和二条相同的分子量较大的肽链(重链)组成。轻链与重链是由二硫键连接形成一个四肽链分子称为Ig分子的单体；单体是构成所有免疫球蛋白分子的基本结构；所有抗体的单体都是四条肽链的对称结构，即：两条糖基化重链(H)和两条非糖基化轻链(L)；每条重链和轻链分为氨基端(N端)和羧基端(C端)。,抗体基础知识概述,8,可变区和恒定区1.可变区（variableregion，V区）：位于Ig分子N端，并决定抗体与抗原结合的特异性；2.恒定区（constantregion,C区)：位于Ig分子的C端，在同一种属中，同一类重链和同一类轻链C区氨基酸的组成或排列比较恒定。介导Ig多种生物学功能,抗体基础知识概述,9,依据免疫球蛋白的重链，可分为5类，、链，五类免疫球蛋白分别称为：IgM，IgG，IgA，IgD和IgE。,抗体基础知识概述,10,不同抗原表位刺激所产生不同的抗体分子，其识别抗原的特异性不同（V区不同）同一抗原表位诱生的不同类型的抗体，其识别抗原的特异性相同（C区不同）免疫球蛋白有不同种类免疫球蛋白同时可作为抗原，其具有不同的抗原特异性，因此免疫球蛋白具有异质性。,抗体基础知识概述,11,一抗的选择,12,一抗的选择,检测任何目的靶蛋白通常都有不止一种抗体可供选择，为缩小抗体的选择范围，筛选出合适的抗体，需要考虑如下几种因素：1、分析试验应用的类型2、样本蛋白的结构性质3、样本的种属4、一抗宿主的种类5、抗体的标记和检测,13,一抗的选择,1、分析试验应用的类型一般抗体说明书都列出该抗体经试验验证过适用于何种分析类型，如：可以应用于WBIHCICCELASA分析等，如果抗体说明书没有提及的应用类型，并不意味着该抗体不适用于此种分析应用类型，而仅是说明尚未经过此种分析试验验证，如果抗体不适用某些分析试验，则会在抗体说明书上标注出来不适于某分析试验。,14,一抗的选择,2、样本蛋白的结构性质了解样本蛋白的结构性质有助于选择最合适的抗体，至少需要从以下几方面进行考虑：待测样本蛋白的结构域：抗体是由各种不同免疫原免疫宿主而制备得来，其中的免疫原包括：全长蛋白、蛋白片断、多肽、全有机体（如：细菌）或细胞，抗体说明书一般都有免疫原的描述，如果打算检测的是蛋白片断或一种特殊的同型物或蛋白全长的某一区域，则必须选择用含此片段域的免疫原制备出的抗体。如果打算用FACS流式检测活细胞的表面蛋白，则需要选择含该表面蛋白的胞外域来免疫制备的抗体。,15,3、样本的种属应选择物种相同或有交叉反应的抗体，抗体可能与不同物种的同种靶蛋白有交叉反应，因其氨基酸序列同源性较高，如果样本的种类未列入抗体说明书上的交叉反应种属表中，并不意味着该抗体不适用于检测该物种的蛋白，而只是表示该物种尚未用此抗体检测验证过，应通过序列比对的方法来预测交叉反应，可应用NCBIBLAST来进行不同物种蛋白同源性比对。,一抗的选择,16,一抗的选择,4、一抗宿主的种类选择一般说来，在使用偶联二抗结合无偶联物的一抗时，一抗宿主动物的物种选择较为重要，对于免疫组化而言，尽可能选择与样本不同种系物种的一抗，从而避免二抗与样本内源性免疫球蛋白产生交叉反应。例如：检测小鼠样本蛋白，则不应选择小鼠或大鼠源的一抗，最好选兔源的一抗，则二抗则可选择偶联了检测分子（酶、荧光素、生物素等）的抗兔IgG。,17,一抗的选择,5、抗体的标记和检测抗体的标记检测可分为直接法和间接法两大类。直接法是将抗体经过纯化，再用一种易于识别的示踪剂标记，然后使其直接与抗原结合，通过检测抗体上的标记物来测定相应抗原。在间接法中，抗体既不用标记也无须纯化，当其与抗原结合后经过洗涤除去未结合的抗体，再通过二级试剂如标记的抗免疫球蛋白抗体或蛋白A、蛋白G等来检测抗原抗体复合物。,18,一抗的选择,5、直接法和间接法的选用当使用标记二抗时，无须自己制备标记反应试剂，可从许多厂商购买。有关试剂可大批量制备并经过检定，经济实用。通常情况下，推荐使用间接法和商品化试剂。但有时，必须使用直接标记的抗体。最常见的情况是共定位研究，即需要在同一细胞或组织标本中定位分析两种或多种抗原。在这种情况下，每一抗体都需经过纯化并标记不同的示踪物，以便对相应抗原的位置做出对比。此外，当背景因素影响结果时，使用标记的一抗是行之有效的方法。,19,二抗的选择,20,二抗的选择,二抗广义上是指专门和一抗进行特异性反应和结合的抗体，即抗体的抗体，其主要作用是检测抗体的存在，放大一抗的信号。利用抗原-抗体反应原理，就是以一抗作为探针，它与目的蛋白作用并连接，再用带有荧光（或同位素）标记的二抗与一抗作用，最后显色，发光位置就有目的蛋白。,21,二抗的选择,22,二抗的选择,23,二抗的选择,24,常见的抗体供应商抗体筛选,25,常见抗体供应商：Abcam,网址链接：,常见抗体供应商抗体筛选,26,Abcam中搜索GAPDH界面截图,由图，可发现有