生物实验技术：第九章 照相与显微照相VIP

第九章显微摄影技术,第一节照相机的结构和应用第二节感光片的冲洗、印相与放大第三节显微摄影第四节数字显微摄影系统（一般了解）,第一节照相机的结构和应用,第九章,机械相机、单反相机与普通数码相机工作原理,镜头光圈快门取景器和测距器景深表暗箱,（一）镜头：,焦距（f）：,摄影时，焦距的长度与成像的大小成正比（物距相同时），与景深成反比,决定了相机性能高低,第九章,一、照相机的结构,镜头的分类：据焦距长度,1.标准镜头：,镜头焦距=所用底片对角线,50mm（75/80）,2.广角镜头（短焦距镜头）：,镜头焦距所用底片对角线,3.远摄镜头（望远镜头）：,镜头焦距所用底片对角线,4.变焦镜头：,第一节照相机的结构和应用,第九章,（二）光圈,作用：控制镜头通光量；调节景深范围大小,光圈系数（F系数）：,=焦距/通光孔径,注意：镜头上光圈系数数值越大，通光量越小。相邻两级光圈前一级比后一级的通光量大一倍。,感光力：,第一节照相机的结构和应用,第九章,1.7，2.8，4，5.6，8，11，16，22,（三）快门,作用：控制曝光时间,镜间快门焦点平面快门,快门速度：,B,T,注意：（1）相邻的两级快门速度，前一级比后一级曝光量大1倍,（2）摄影时，快门速度与光圈系数要配合使用,（3）同一个曝光量，光圈系数与快门速度的配合可有几种不同的组合。如：16，1/60s；11，1/125s；8，1/250s,第一节照相机的结构和应用,第九章,1，2，4，8，15，30，60，125，250倒数,（四）取景器和测距器,连动测距器,调焦方式：,3.菲涅尔全视场聚焦屏调焦,4.毛玻璃取景屏调焦,第一节照相机的结构和应用,第九章,（五）景深表,距离标尺景深标尺,焦距、景深、光圈的关系：,摄影距离一定时，光圈越小，景深越大,光圈一定时，被摄物越远，景深长，反之，景深短,同一物距时，镜头焦距长短与景深成反比,第一节照相机的结构和应用,第九章,（六）暗箱,第一节照相机的结构和应用,第九章,二、与摄影有关的几个名词,景深：观察到的景物的深度。被摄景物清晰的前后距离。,反差：景物的明暗差别和影像的黑白色调差别,倒易律与倒易律失效,总曝光量=光强度（照度）曝光时间,第一节照相机的结构和应用,第九章,三、使用照相机的基本常识,1.平直端正、持稳、测距准确,2.近距离拍摄时，加近摄圈或近摄镜,3.慢速度拍摄时（长于1/30秒），要用三角架显微摄影时，用快门线,4.遵守操作程序，先卷片再按快门,第一节照相机的结构和应用,第九章,一、感光片的分类与结构,（一）感光片的分类,1.据使用相机的型号：135,120,2.据用途,负片：彩色、黑白正片（拷贝片）反转片,3.据感色性能,色盲片分色片全色片,第二节感光片的冲洗、显印与放大,4.据感光速度,特慢速（GB8）、慢速（GB14）、中速（GB17）、快速（GB21）、特快速（GB24）,感光片的感光度每相差3，感光速度就相差1倍，曝光时间要相应快、慢相差1倍，或光圈大、小相差1级。,红橙黄绿青兰紫色盲片分色片全色片,（二）感光片的结构,保护层：,结合层（特殊化学胶液）,乳剂层：,片基（醋酸纤维）,防光晕层,厚12m透明胶膜,明胶+卤化银（AgBr+AgI）,银盐颗粒越细分布越均匀成像质量越好,彩色感光片：银盐颗粒细分布均匀三原色平衡,第二节感光片的冲洗、显印与放大,第九章,二、感光片的冲洗,（一）感光片冲洗中常用药品及其性能,1.软水剂:,EDTA二钠；六偏磷酸钠,2.显影剂：,米吐尔；对苯二酚；菲尼酮,3.保护剂:,无水亚硫酸钠；亚硫酸氢钠,4.促进剂：,无水碳酸钠；硼砂,5.抑制剂：,溴化钾；苯胼三氮唑,6.坚膜剂：,钾明矾；铬明矾,7.定影剂：,硫代硫酸钠（大苏打）,8.中和剂：,醋酸；硼酸,第二节感光片的冲洗、显印与放大,第九章,（二）感光片的冲洗程序,1.显影:,D-76显影液（感光片）,温水750ml米吐尔2g无水亚硫酸钠100g对苯二酚5g硼砂2g加水至1000ml,D-72显影液（感光纸）,温水500ml米吐尔3.1g无水亚硫酸钠45g对苯二酚12g无水碳酸钠67.5g溴化钾1.9g加水至1000ml,（18-20），显影时间根据厂家推荐,第二节感光片的冲洗、显印与放大,2.停影(停显）:28%冰醋酸24ml，蒸馏水500ml20-30s,3.定影:,溶解掉未感光的卤化银,酸性坚膜定影液-5（20）,4.水洗干燥,温水600ml硫代硫酸钠240g无水亚硫酸钠15g醋酸（28%）48ml硼酸7.5g钾矾15g加水至1000ml,第二节感光片的冲洗、显印与放大,第九章,（二）感光片的冲洗程序,三、印相,第二节感光片的冲洗、显印与放大,第九章,（一）感光纸的构造,AgCl（印相）AgBr（放大）AgCl+AgBr（两用）,（二）感光纸的性质与选择,感光纸的号数：小大反差：弱强纸性：软硬,印相与放大根据底片的性质选择感光纸：软性底片硬性相纸硬性底片软性相纸,（三）印相程序,曝光、显影、停影、定影、水洗、干燥（涂塑）、上光,相纸药膜面朝下底片药膜面朝上,四、放大,（一）放大机的构造,（二）放大程序,底片药膜面朝下相纸药膜面朝上,第二节感光片的冲洗、显印与放大,第九章,光室,放大镜,皮腔,镜头遮光片,放大尺板,底片夹,奶白放大泡,第三节显微摄影,一、显微摄影的装置及应用,1.生物摄影显微镜,2.显微摄影对物镜与目镜的选择：,平场(半)复消色差物镜,照相目镜（补偿目镜）,4.物镜与聚光器的配合使用,注意：屈光调节、挡光板的使用,第九章,二、影响显微摄影曝光时间的因素,1.光线的强弱与性质,2.底片的性质全色片分色片色盲片/感光度,3.放大倍数,照度平方反比定律,曝光时间与放大倍数的平方成正比。,4.物镜数值孔径,物镜的集光能力依数值孔径的平方而增大,5.标本的性质,6.滤光片,色温(colortemperature)：即光源的放射能，由波长即光的颜色来表现的。物理学中，铁、钨等黑色金属从绝对零度(-273)起开始加温，随着温度增高而出现的色光，称作光源色温度，简称色温，以“K”(开尔文）表示，每升高1即为1K。800K时，出现暗红色；日光为5600K；天蓝光为25000K。,第三节显微摄影,第九章,三、决定曝光时间的方法,1.光电测光表,2.基础曝光试验几何级数,四、滤光片(镜)的使用,增强图像的反差及分辨率,第三节显微摄影,第九章,第四节数字显微照相系统,第九章,纳米显微学（nanoscopy）,【2014诺贝尔奖】化学奖揭晓：看到纳米的世界,光学显微技术无法突破一条极限：它永远不可能获得比所用光的半波长更高的分辨率(0.2微米)2014年诺贝尔化学奖得主于2014年被授予诺贝尔化学奖，正是由于突破了这个极限使用荧光分子，巧妙地绕开了这一极限。他们突破性的工作将光学显微技术带到了纳米尺度。艾力克贝齐格（EricBetzig）、斯特凡W赫尔（StefanW.Hell）和WE莫尔纳尔（W.E.Moerner）,其一：斯特凡W赫尔在2000年发明的受激发射损耗（STED）显微技术。这项研究使用了两道激光束，一束用来激发荧光分子使其发光，另一束则将大部分发光抵消除了一块纳米尺度的微小区域。显微镜一纳米一纳米地扫描样本，并产生图像，其分辨率远好于阿贝分辨率的限制。,艾力克贝齐格和威廉姆莫尔纳尔各自独立做出的成就，为第二种方法单分子荧光显微术打下了基础。这种技术关键是发现可以打开和关闭单个分子的荧光。对同一区域多次成像，每次只让几个零散的分子发出荧光。通过对这些图像进行叠加，他们得到了一幅纳米级分辨率的超级稠密图像。2006年，埃里克白兹格首次将这种技术投入了实际运用。,果蝇囊胚的肌动蛋白的普通荧光显微镜（A）与激光扫描共聚焦显微镜图像（B）比较,复习题：1.照相机镜头上的符号及数据的含义？2.前后相邻两