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探究MoTlg2（M）基因在稻瘟菌菌丝极性生长中的作用机理,李超2019.3.22,背景资料1稻瘟菌(Magnaportheoryzae)侵染水稻引起的稻瘟病是水稻最重要的真菌病害之一研究稻瘟菌菌丝生长相关机理,有助于深入揭示稻瘟菌致病的分子机理、从而发现靶标基因用于新农药的设计和筛选,达到控制病害的目的已知稻瘟病菌的全基因组序列已被完全测定；同时，已知M基因对菌丝生长起重要作用，且广泛存在于酵母等丝状真菌中,6000万人,背景资料1稻瘟菌(Magnaportheoryzae)侵染水稻引起的稻瘟病是水稻最重要的真菌病害之一研究稻瘟菌菌丝生长相关机理,有助于深入揭示稻瘟菌致病的分子机理、从而发现靶标基因用于新农药的设计和筛选,达到控制病害的目的已知稻瘟病菌的全基因组序列已被完全测定；同时，已知M基因对菌丝生长起重要作用，且广泛存在于酵母等丝状真菌中,材料信息1稻瘟菌野生型菌株P131M基因在P131基因组中的位置情况,图1野生型稻瘟菌菌株P131的菌落形态（5d）,问题1：如何用实验证明M基因在稻瘟菌菌丝生长中的作用,问题2：用什么生物学技术可以将M基因敲除掉，涉及几个步骤？,背景资料2,图3同源重组原理示意图,应用基因同源重组法敲除基因可以研究某一基因的功能同源重组在细胞中自然发生，交叉互换的位点必须发生在特定的同源序列中,材料信息2稻瘟菌野生型菌株P131和P质粒,注：为基因的转录方向SpeI、Sal等为限制酶LB为M基因上游的同源序列RB为M基因下游的同源序列NEO为抗新霉素基因HPT为抗潮霉素基因,P131,按照基因工程的基本操作程序，应用同源重组的原理，用P质粒载体上的抗潮霉素（HPT）基因替换稻瘟菌基因组中的基因，实现M基因敲除,主要任务,1.获取目的基因,获取哪段序列作为目的序列？什么方法获取？,注：为基因的转录方向SpeI、Sal等为限制酶LB为M基因上游的同源序列RB为M基因下游的同源序列NEO为抗新霉素基因HPT为抗潮霉素基因,P131,2.构建基因表达载体,注：为基因的转录方向SpeI、Sal等为限制酶LB为M基因上游的同源序列RB为M基因下游的同源序列NEO为抗新霉素基因HPT为抗潮霉素基因,P131,选用什么工具？什么工具酶？构建过程的顺序？,2.构建基因表达载体,P131,步骤1,NEO,HPT,Ori,RB,HindIII、SalI,2.构建基因表达载体,P131,步骤2,SpeI、PstI,3.导入受体细胞,P131,注：为基因的转录方向SpeI、Sal等为限制酶LB为M基因上游的同源序列RB为M基因下游的同源序列NEO为抗新霉素基因HPT为抗潮霉素基因,用NotI将重组质粒线性化，导入野生型P131受体细胞,初步筛选？,导入受体细胞后，获得的转化子打孔5天之后测量菌落直径的结果,4.目的基因的检测与鉴定,4.目的基因的检测,DNA分子杂交,4.目的基因的鉴定,P131,哪个样品是真正的M基因敲除体？,P131,M基因敲除突变体,M基因在菌丝极性生长中的作用机理,背景资料3：顶体结构是真菌的菌丝顶端的一个动态结构，它与菌丝的极性生长有关。FM464是一种内吞性染料，它可以进入顶体，从而证明内吞囊泡参与了顶体