ANCA荧光判读与讲解

抗中性粒细胞胞浆抗体（ANCA）,相关疾病IIF染色型特异性靶抗原抗体韦格纳氏肉芽肿(WG)c,p(少见)PR3(85%),MPO(10%)显微型多动脉炎(MPA)c,pPR3(30%),MPO(70%)坏死性新月体肾小球肾炎p,c(少见)PR3(25%),MPO(65%)（NCGN）过敏性肉芽肿性血管炎(CSS)p,c(少见)PR3(10%),MPO(60%)结节性多动脉炎(PAN)低阳性率PR3(5%),MPO(15%)抗肾小球基底膜疾病pMPO(30%)（抗GBM病）,ANCA临床意义(1)：原发性系统性小血管炎,相关疾病IIF染色型特异性靶抗原抗体炎症性肠病溃疡性结肠炎(UC,60-80%)p,aBPI,lamina？其它克罗恩病(Crohns病,10-20%)p,aBPI,lamina？其它自身免疫性肝病原发性硬化性胆管炎(PSC,70-88%)p,aactin?BPI,其它原发性胆汁性肝硬化(PBC,3-18%)p,aactin?BPI,其它自身免疫性肝炎(AIH)p,aactin?BPI,其它结缔组织病系统性红斑狼疮(SLE)p,aLF,CG,MPO(少见)类风湿性关节炎(RA)p,aLF,CG,MPO(少见)Felty综合征p,aLF,CG,MPO(少见),ANCA临床意义(2)：IBD/ALD/CTD,相关疾病IIF染色型特异性靶抗原抗体药物性ANCA阳性血管炎药物性狼疮(DIL)pMPO（常见）LF,HEL甲状腺功能亢进(PTU治疗)p,aMPO,LF,HEL,BPI,其它呼吸系统炎性疾病囊性纤维化(CF)a,pBPI（91%）原发性支气管扩张症a,pBPI，其它原发性支气管扩张a,pBPI，其它感染性疾病细菌(心内膜炎、呼吸道感染)a,pBPI，CG，其它病毒(HIV感染)a,p不明真菌(着色真菌病)a,p不明原虫(急性疟疾、侵袭性阿米巴感染)a,pCG，PR3,ANCA临床意义(3)：药物性/感染性疾病,ANCA检测方法及检测指标,ANCA(抗中性粒细胞胞浆抗体),ANCA=Anti-NeutrophilCytoplasmAutoantibodies,中性粒细胞结构：细胞直径10-12um，核呈深染的弯曲杆状（马蹄铁形）或分叶状，分叶核一般为25叶，叶间有前戏的缩窄部相连。,ANCA(抗中性粒细胞胞浆抗体),欧蒙公司产品基质是从O型血的人血中提取出来的中心粒细胞。ANCA的靶抗原位于中心粒细胞胞浆中，ANCA是从间接免疫荧光法中发现的。ANCA分两种：cANCA及pANCA。,ANCA检测方法及指标,间接免疫荧光法,ELISA方法/欧蒙印迹法,ANCA检测和报告的国际公识(Savige,vanderWoude,Wiiketal.,1999),间接免疫荧光法是检测ANCA的经典方法,特点：敏感性高，半定量，是区分cANCA和pANCA的基础局限性：间接免疫荧光法测定的是总ANCA，不能区分靶抗原，需要确认实验作为补充,间接免疫荧光法检测ANCA,核周型ANCA（pANCA）胞浆型ANCA（cANCA）,间接免疫荧光法检测ANCA,细胞核周围呈现平滑的带状荧光，细胞核阴性,细胞浆呈现不均匀的颗粒样荧光，有时形成小团块或粗大颗粒，核分叶处有荧光增强,两种ANCA荧光染色成因,甲醛的强固定作用细胞浆中ANCA抗原如MPO不能从嗜天青颗粒中释放，表现为胞浆内均一的荧光染色即c-ANCA,无水乙醇固定时，MPO等抗原物质可以从嗜天青颗粒中释放出来，由于电荷作用吸附在细胞核周围形成p-ANCA,ANCA筛查:免疫荧光,cANCA,ANCA判读,建议读片顺序：粒细胞(乙醇固定)粒细胞(甲醛固定)HEP-2猴肝判读,cANCA,pANCA,HEp-2cells,cANCA,粒细胞(乙醇固定),粒细胞(甲醛固定),猴肝,1,3,4,2,cANCA:靶抗原,蛋白酶3(PR3)杀菌性/通透性增强蛋白(BPI;CAP57)其它未知抗原,cANCA:相关疾病,韦格纳肉芽肿（WG）-典型的WG：可逐渐发展成为肾小球肾炎90%-局限性的WG：可不累及肾小球70%显微镜下多动脉炎（MPA）upto30%变应性肉芽肿性血管炎（Churg-Strauss综合征）10-20%结节性多动脉炎(PAN)5-10%,注意区分ANA对荧光模型的干扰,抗溶酶体抗体,粒细胞(乙醇固定),猴肝,粒细胞(甲醛固定),HEp-2cells,1,3,4,2,pANCA,pANCA（甲醛抗性）,粒细胞(乙醇固定),猴肝,粒细胞(甲醛固定),HEp-2cells,HEp-2cells,1,3,4,2,pANCA（甲醛敏感）,粒细胞(乙醇固定),猴肝,粒细胞(甲醛固定),HEp-2cells,1,3,4,2,pANCA:靶抗原,髓过氧化物酶(MPO;甲醛固定;甲醛抗性)乳铁蛋白弹性蛋白酶组织蛋白酶G（甲醛敏感）杀菌性/通透性增强蛋白(BPI;CAP57)-烯醇化酶-葡萄糖醛酸酶溶菌酶Azurocidine(CAP37).,请参考上文2-4页相关疾病与其靶抗原,pANCA:相关疾病,原发性血管炎（MPO）显微镜下多动脉炎42-70%变应性肉芽肿性血管炎18-60%,结缔组织病SLE9-25%类风湿性关节炎3-20%,慢性炎症性肠病溃疡性结肠炎76%克隆恩氏病7%,自身免疫性肝病原发性硬化性胆管炎87%AIHtype1/PBC?,注意区分ANA对荧光模型的干扰,ANA+pANCA与ANA,猴肝,猴肝,ANA+pANCA,ANA,均质型ANA的干扰,粒细胞(乙醇固定),猴肝,粒细胞(甲醛固定),HEp-2cells,1,3,4,2,核膜型ANA的干扰,猴肝,粒细胞(甲醛固定),HEp-2cells,粒细胞(乙醇固定),1,3,4,2,ANA+pANCA（甲醛抗性）,粒细胞(乙醇固定),猴肝,粒细胞(甲醛固定),HEp-2cells,1,3,4,2,ANA+pANCA（甲醛敏感）,粒细胞(乙醇固定),猴肝,HEp-2cells,粒细胞(甲醛固定),1,3,4,2,1,3,4,2,ANA干扰ANCA阴性,EUROIMMUN,猴肝,HEp-2细胞,粒细胞(乙醇固定),粒细胞(甲醛固定),1,3,4,2,阴性,EUROIMMUN,猴肝,HEp-2细胞,粒细胞(乙醇固定),粒细胞(甲醛固定),1,3,4,2,甲醛抗性pANCA,EUROIMMUN,猴肝,HEp-2细胞,粒细胞(乙醇固定),粒细胞(甲醛固定),1,3,4,2,甲醛抗性pANCA,猴肝,HEp-2细胞,粒细胞(甲醛固定),粒细胞(乙醇固定),1,3,4,2,ANCA阴性,ANCA常见问题答疑,关于ANCA：理论知识：,一、实验结果与理论知识不符,IFT为C-ANCA，靶抗原为MPO,结果的解释（1）,作者证明了抗MPO抗体成为C-ANCA的原因：抗MPO抗体为一组异质性抗体，其中某个亚群的靶抗原（即MPO蛋白）被与乙醇反应后不会向胞膜移动。,IFT为C-ANCA，靶抗原为MPO样本稀释后实验结果：IFT为强C-ANCA+弱pANCA靶抗原结果为：弱MPO+强BPI,结果的解释（2）,提醒：强C-ANCA有时会掩盖弱pANCA;ANCA的靶抗原检测多数医院还是很有局限,ANCA谱ELISA-可同时检测6种靶抗原,蛋白酶3,乳铁蛋白,髓过氧化物酶,弹性蛋白酶,组织蛋白酶G,BPI(CAP57),pANCA,二、检测方法学选择上的问题,仅RP3和MPO,仅定性，无定量,单基质/两基质片，未排除ANA干扰,仅IIF,临床应用范围受限,降低疾病特异性,假阳性,给临床信息少,国内ANCA临床常规检测存在的问题,两种方法联合使用，可提高ANCA临床应用价值原发性系统性小血管炎患者约5%IIFT阴性而ELISA阳性,ANCA检测方法的合理选择,据国内外报道，采用IIF在SLE中检测ANCA，阳性率差异很大，16%-69%，主要为pANCA仅采用乙醇片判断，ANA干扰大据欧蒙检测数据，SLE中单独采用乙醇固定抗原片检测ANCA，由于ANA干扰可产生31.2%的假阳性结果，主要为均质型的ANA（占77.8%）推荐：IIF法检测ANCA提倡应用组合抗原片（甲醛固定片、乙醇固定片、Hep-2细胞片等），综和判断结果，避免ANA干扰，提高ANCA临床应用价值,ANCAIIF法检测的影响因素-ANA,需求：抗PR3