遗传学第六章课后习题解答

第六章 真菌类的染色体作图课后习题及答案 1在红色面包霉中，ab是任意两个基因。杂交组合为ab*+,每个杂交分析了100个子囊，结果如下表： 子囊包子的类型和数目 aba+abababa+a+ aba+a+b+b+b +b+b+ +b+ba+aba+ab134343200002841150000355340020047111818015962422810206310136104对每一个杂交，分析基因之间连锁关系和遗传距离，确定基因与着丝粒间的距离。答：对上表进行分析如下： aba+abababa+a+ aba+a+b+b+b +b+b+ +b+ba+aba+ab分类PDNPDTTTTPDNPDTTa基因分离MIMIMIMIIMIIMIIMIIb基因分离MIMIMIIMIMIIMIIMII(1).对第一个杂交进行分析：要判断a与b之间是否发生连锁，即要比较PD和NPD类型的数目，若有连锁存在时，则不发生交换（PD类型）减数分裂细胞的数目应明显多于发生四线交换（NPD类型）的细胞数目，即PDNOD时，表明有连锁存在。对第一个杂交分析可知其PD=NPD,因此说a与b之间不存在连锁，a与b之间就不存在遗传距离。由于基因-着丝粒距离是MII离子囊类型百分率的1/2，所以重组率=1/2重组型子囊数/总子囊数*100%。a与着丝粒间的遗传距离=1/2*0/100*100=0cMb与着丝粒间的遗传距离=1/2*32+0/100*100=16 cM(2).对第二个杂交进行分析：由于PD类型远大于NPD类型，即PDNOD，表明a与b连锁。a与b之间的遗传距离=50*（TT+6NPD）=50*(15/100+6*1/100)=10.5 cMa与着丝粒间的遗传距离=1/2*0/100*100=0 cMb与着丝粒间的遗传距离=1/2*15/100*100=7.5 cM由此可知a与b位于着丝粒的两端。（3）.对第三个杂交进行分析： 由于PD类型远大于NPD类型，即PDNOD，表明a与b连锁。 a与b之间的遗传距离=50*（TT+6NPD）=50*（40/100+6*3/100）=29 cM a与着丝粒间的遗传距离=1/2*2/100*100=1 cM b与着丝粒间的遗传距离=1/2*（40+2）/100*100=21 cM b与着丝粒间的遗传距离=1/2*（4）.对第四个杂交进行分析： 由于PD类型远大于NPD类型，即PDNOD，表明a与b连锁。 a与b之间的遗传距离=50*（TT+6NPD）=50*（18+1+1）/100+6*1/100）=13 cM a与着丝粒间的遗传距离=1/2*（1+8+1）/100*100=5 cM b与着丝粒间的遗传距离=1/2*（18+8+1）/100*100=13.5 cM 由上可知a位于b与着丝粒之间。（5）.对第五个杂交进行分析： 由于PD类型远大于NPD类型，即PDNOD，表明a与b连锁。 a与b之间的遗传距离=50*（TT+6NPD）=50*（24+22+20）/100+6*（6+10）/100）=81 cM b间的遗传距离=1/2*（22+8+10+20）/100*100=30 cM b与着丝粒间的遗传距离=1/2*（24+8+10+20）/100*100=31 cM 由此可知a与b位于着丝粒的两端。（6）.对第六个杂交进行分析： 由于PD类型远大于NPD类型，即PDNOD，表明a与b连锁。 a与b之间的遗传距离=50*（TT+6NPD）=50*（1+3+4）/100+6*0/100）=4 cM a与着丝粒间的遗传距离=1/2*（3+61+4）/100*100=34 cM b与着丝粒间的遗传距离=1/2*（1+61+4）/100*100=33 Cm= 由此可知b位于a与着丝粒之间。 2.在酵母中ura3是尿嘧啶营养缺陷型突变，lys4是赖氨酸营养缺陷型突变，在杂交ura3+*+lys4中，获得了300个无序四分子体，分类如下：ura3+ura3 lys4ura3+lys4ura3 lys4ura3+ura3 lys4+lys4+lys413812150请回答：（1）. ura3和lys4间的重组频率是多少？校正后的遗传距离是多少？（2）.假设减数分裂中这两个位点间只发生0,1,2次交换，那么发生0次，1次，2次交换的减数分裂的频率如何？ 答：首先对表进行分析： ura3+ura3 lys4ura3+ +lys4ura3 lys4ura3+ ura3 lys4+lys4 +lys4数目13812150分类TTNPDPD 1）.由上可知：PDNPD,表明ura3和lys4之间发生连锁。ura3和lys4之间的重组率Rf=1/2TT+NPD=(1/2*138/300+12/300)*100%=27%校正后的遗传距离=50*（TT+6NPD）=50*(138/300+6*12/300)=35 cM（2）.在某一特定的染色体区域发生0次，1次，2次等不同类型交换的频率符合波松分布。用函数公式表示为f(i)=e(-m)m(i)/i!.式中i是交换发生的次数，f(i)是发生某一类型交换的频率，e是自然对数的底，m是每个减数分裂细胞在这一特定区域发生交换的平均次数。 M=TT+6NPD=0.7发生0次交换的频率f(0)= 2.018发生1次交换的频率f(1) =1.413发生2次交换的频率f(2)= 0.494。 3.减数分裂和有丝分裂时，染色体内重组既可以发生在姊妹染色单体间又可发生在非姊妹染色单体间。它们的遗传效应是什么？对后代的遗传变异有何影响？ 答：有丝分裂和减数分裂的区别：有丝分裂 减数分裂 ：发生在所有正在生长着的组织中从合子阶段开始，继续到个体的整个生活周期无联会，无交叉和互换使姊妹染色体分离的均等分裂每个周期产生两个子细胞，产物的遗传成分相同子细胞的染色体数与母细胞相同 只发生在有性繁殖组织中高等生物限于成熟个体；许多藻类和真菌发生在合子阶段有联会，可以有交叉和互换后期I是同源染色体分离的减数分裂；后期II是姊妹染色单体分离的均等分裂产生四个细胞产物（配子或孢子）产物的遗传成分不同，是父本和母本染色体的不同组合为母细胞的一半。 有丝分裂的遗传意义： 首先：核内每个染色体，准确地复制分裂为二，为形成的两个子细胞在遗传组成上与母细胞完全一样提供了基础。其次，复制的各对染色体有规则而均匀地分配到两个子细胞的核中从而使两个子细胞与母细胞具有同样质量和数量的染色体。 例如，水稻n12，其非同源染色体分离时的可能组合数为212 = 4096。各个子细胞之间在染色体组成上将可能出现多种多样的组合。 此外，同源染色体的非妹妹染色单体之间还可能出现各种方式的交换，这就更增加了这种差异的复杂性。为生物的变异提供了重要的物质基础。 减数分裂的遗传学意义： I.保证了有性生殖生物个体世代之间染色体数目的稳定性。 通过减数分裂导致了性细胞（配子）的染色体数目减半，即由体细胞的2n条染色体变为n条染色体的雌雄配子，再经过两性配子结合，合子的染色体数目又重新恢复到亲本的2n水平，使有性生殖的后代始终保持亲本固有的染色体数目，保证了遗传物质的相对稳定。 II.为有性生殖过程中创造变异提供了遗传的物质基础： （1）通过非同源染色体的随机组合;各对非同源染色体之间以自由组合进入配子，形成的配子可产生多种多样的遗传组合，雌雄配子结合后就可出现多种多样的变异个体，使物种得以繁衍和进化，为人工选择提供丰富的材料。 （2）通过非姐妹染色单体片段的交换：在减数分裂的粗线期，由于非姐妹染色单体上对应片段可能发生交换，使同源染色体上的遗传物质发生重组，形成不同于亲代的遗传变异。 减数分裂的生物学意义 减数分裂是遗传学的基础。具体表现在： I、在减I分裂过程中，因为同源染色体分离，分别进入不同的子细胞，故在子细胞中只具有每对同源染色体中的一条染色体。减数分裂中同源染色体的分离，正是基因分离律的细胞学基础。 2、同源染色体联会时，非姐妹染色单体之间对称的位置上可能发生片段交换，也就是父源和母源染色体之间发生遗传物质的交换。这种交换可使染色体上连锁在一起的基因发生重组，这就是染色体上基因连锁和互换的细胞学基础。 由于减数分裂，使每种生物代代都能够保持二倍体的染色体数目。在减数分裂过程中非同源染色体重新组合，同源染色体间发生部分交换，结果使配子的遗传基础多样化，使后代对环境条件的变化有更大的适应性。保证了有性生殖生物个体世代之间染色体数目的稳定性通过减数分裂导致了性细胞（配子）的染色体数目减半，即由体细胞的2n条染色体变为n条染色体的雌雄配子，再经过两性配子结合，合子的染色体数目又重新恢复到亲本的2n水平，使有性生殖的后代始终保持亲本固有的染色体数目，保证了遗传物质的相对稳定。 II.为有性生殖过程中创造变异提供了遗传的物质基础： （1）通过非同源染色体的随机组合;各对非同源染色体之间以自由组合进入配子，形成的配子可产生多种多样的遗传组合，雌雄配子结合后就可出现多种多样的变异个体，使物种得以繁衍和进化，为人工选择提供丰富的材料。 （2）通过非姐妹染色单体片段的交换：在减数分裂的粗线期，由于非姐妹染色单体上对应片段可能发生交换，使同源染色体上的遗传物质发生重组，形成不同于亲代的遗传变异。 有丝分裂重组的特点及遗传学意义 遗传学是研究生物的遗传与变异的科学,是研究生物体遗传信息的组成、传递和表达规律的一门科学。遗传与变异现象在生物界普遍存在,是生命活动的基本特征之一。遗传与变异相辅相成,生物的适应与进化的基础是可遗传的变异,而变异的来源则是突变和重组。重组是遗传的基本现象,无论是高等真核生物,还是细菌、病毒都存在基因重组现象,只要有DNA就会发生重组。一般认为的重组是指在配子形成的减数分裂过程中一对同源染色体的非姐妹染色单体之间的重组,而在有丝分裂过程中,一对同源染色体通常不发生配对。然而,已有实验证据表明,在果蝇和一些其它二倍体生物中确实会发生非姐妹染色单体间的遗传交换。二倍体体细胞通过有丝分裂产生基因型与其不同的子细胞的过程称为有丝分裂重组(m itotic recomb ina-tion)或有丝分裂交换(m itotic crossing over)或体细胞交换(somatic crossing over)。1有丝分裂重组的发现1936年,Curt Stern在果蝇中首先发现了体细胞在有丝分裂过程中发生染色体交换的现象。 真菌被广泛用于有丝分裂分离和重组研究。真菌的无性世代主要是单倍体，为了观察分裂重组，首先必须创造二倍体真菌细胞。许多真菌可以自然形成二倍体。单倍体菌丝相互混合后发生融合，形成可进行有丝分裂的二倍体，称为异性核。二倍体在生长过程中同源染色体对中的一条又可能会丢失，导致二倍体的单倍化。所有隐性基因在单倍化菌丝的培养过程中都会表现出来，为基因连锁研究提供非常有价值的信息。 有丝分裂重组使杂合位点纯和化。这种遗传交换信息也可以用于基因定位，其频率的高低反映距离的远近。有丝分裂重组频率很低，在已知进行有丝分裂重组的生物体中，有丝分裂交换发生的频率在1%甚至更低。 4.与形态学，生化标记相比，DNA分子标记有哪些优点？ 答：形态标记是遗传标记的一种，指肉眼可见的或仪器测量动物的外部特征(如毛色、体型、外形、皮肤结构等)，以这种形态性状、生理性状及生态地理分布等待征为遗传标记，研究物种间的关系、分类和鉴定。形态学标记研究物种是基于个体性状描述，得到的结论往往不够完善，且数量性状很难剔除环境的影响，需生物统计学知识进行严密的分析。但是用直观的标记研究质量性状的遗传显得更简单、更方便。目前此法仍是一种有效手段并发挥着重要作用。 生物化学标记是以动物体内的某些生化性状为遗传标记，主要指血型、血清蛋白及同工酶。20世纪60年代以来，蛋白质电泳技术作为检测遗传特性的一种主要方法得到了广泛的应用。蛋白电泳所检测的主要是血浆和血细胞中可溶性蛋白和同工酶中氨基酸的变化，通过对一系列蛋白和同工酶的检测，就可为动物品种内的遗传变异和品种间的亲缘关系提供有用的信息。但是，蛋白和同工酶都是基因的表达产物，非遗传物质本身，它们的表现易受环境和发育状况的影响；这些因素决定了蛋白电泳具有一定的局限性，但是蛋白电泳技术操作简便、快速及检测费用相对较低，日前仍是遗传特性研究中应用较多的方法之一。 生物化学标记经济、方便，且多态性比形态学标记和细胞学标记丰富。已被广泛应用于物种起源与分类研究和动物育种中。 分子标记(Molecular Markers)是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接的反映。与其他几种遗传标记形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相比，DNA分子标记具有的优越性有：大多数分子标记为共显性，对隐性的性状的选择十分便利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析；分子标记揭示来自DNA的变异；表现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简单、迅速。随着分子生物学技术的发展，现在DNA分子标记技术已有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。 分子标记是遗传标记的一类。遗传标记主要有3大类：(1)形态标记，如颜色、大小、高矮等；(2)蛋白质标记，如同功酶等；(3)DNA标记。在这里，分子标记是指DNA标记。DNA标记有许多种，如RFLP、RAPD、AFLP、SCAR、SSR、STS、SSCP和VNTR等。其中的一些标记已成功地应用于植物育种的各个方面。 1形态标记 60年代以前，用于植物遗传和育种中的性状主要是形态性状，如矮化性状，抽穗日期，花、种子、叶子的颜色以及抗病性。这些形态学性状对理解孟德尔遗传、建立连锁图谱和培育优良品种起了很重要的作用。但由于形态性状数量有限及很少同重要的经济性状紧密连锁，因而不能直接用于改良多基因控制的性状，如产量、种子含油量等。 同形态标记相比，分子标记有以下优点： (1)在一个分离群体中，可以探测到大量的遗传标记位点，从而有可能建立高密度的连锁图。其多态信息量(polymorphism information content，PIC)比形态标记要高得多。 (2)分子标记同形态标记相比，通常对表型是中性的，没有上位性和多效性。有些形态性状抑制植物生长或表现多效性，这使得基因型的精确鉴定变得更复杂。 (3)除了随机扩增多态DNA(random amplified polymorphism DNA，RAPD)是显性标记外，分子标记通常是共显性的，因而单个位点的信息量比显性或隐性的形态性状多。(4)分子标记能够在组织或细胞水平上，并在任何发育阶段都能被探测到，而形态标记只能在整株并在某个发育阶段才能测定，因而分子标记能够加速选择，尤其是多年生的木本植物。 2同功酶(isoenzyme)标记 自1955年，Smithies发明淀粉胶电泳以后，同功酶技术已被广泛用于测定自然群体中遗传变异的水平和结构，研究群体的遗传漂移，鉴定品种及评价种质资源。用同功酶，遗传标记的数目至少增加了一个数量级，例如Goodman和Stuber(1983)已鉴定了玉米的37个同功酶位点。同功酶是典型的共显性，即同一位点的杂合子和纯合子能够被区别开来，这使得直接估计基因型频率和基因频率等遗传参数成为可能。 虽然大约100个左右的同功酶位点可以被分辨开来，但就某个特定物种而言，只有1040个位点能分辨开来，因而分辨技术不足于建立一个高密度的连锁图。 3限制性片段长度多态性(RFLP) DNA经限制性酶切割，同带有32P的同源探针相结合(southern blot)，并被转移到膜，经同位素显影，不同长度片段就能被区别开来。RFLP的基本原理是，不同生物的DNA序列上是否有可被限制性酶识别的特定的48bp。目前从细菌中已分离到500多个限制性酶，其中几十个已被商业化生产。RFLP最初被用于测定人类基因组的突变及构建人类基因组连锁图。1983年，Beckmann和Soller把RFLP引入植物育种中，今天RFLP已成为植物遗传育种中应用最广泛的分子遗传标记之一。RFLP也是共显性，因而具有同功酶的全部优点。与同功酶相比，RFLP标记的数目几乎是无穷的，其PIC也大得多。与此同时，RFLP具有全部分子标记的优点：高度稳定的DNA能在任何组织的任何时期提取，并可贮存相当长的时间。 RFLP的缺点也是显而易见的，因为在区别RFLP标记时，要使用同位素，因而需要一定的设备，放射性废物也得小心处理。RFLP还包含几个非常费人力和时间的步骤，因而当考虑其在育种中应用时，通常认为同育种家不太友好。另外一个缺点是，对很多物种而言，探针不是现成的。至今为止只有几种主要作物有现成的探针，而要建立一个探针库通常要花去数月乃至一年时间。 4随机扩增多态DNA(RAPD) RAPD标记是建立在Mullis和Faloona(1987)发明的PCR技术基础上的。其基本原理是，同寡核苷酸引物相互补的目标序列经变性、复性、延伸3个步骤得到扩增。但在RAPD反应中，只用一个10bp的引物，而不是一对。实验表明，扩增反应是非常敏感的，1bp的差异足可引起引物模板的错配，从而阻止扩增。 RAPD和RFLP的差异是RFLP建立在DNA的杂交基础上，而RAPD只是目标序列的扩增。这个差异使得RAPD同RFLP相比具有简便和快捷的优点，就投入的时间和人力来讲，RAPD比RFLP效率高46倍，如果把建立探针库也考虑进去，RAPD效率更高，因为同样引物可以用于任何生物，RAPD的第二个优点是，它不需处理放射性废物；第三，RAPD比RFLP更敏感。据Foolad(1993)估计，就番茄种内材料而言，只有16的探针显示多态性，而63RAPD引物至少有一个多态性。 RAPD的缺点是单个位点PIC低，因为RAPD标记是显性的，胶分辨率不足于区别基因型AA和Aa的不同扩增产物。另外由于PCR的敏感性，各个实验室之间的结果难以交流。 除上述的分子标记外，因目标不同，还可使用其他分子标记，如： (1)高度变化序列VNTR(variable number of tandem repeats)，其基本原理与RFLP相同，只是所用探针不同。 (2)简单重复序列SSR(simple sequence：repeat)，其原理也是PCR，但引物是专门设计的一对含2030碱基的DNA片段。(3)扩增片段长度多态性AFLP(amplified fragment length polymorphism)，AFLP把限制性酶切专一性同PCR扩增后快速探测的特性有效结合起来，是一个相对较有效的技术。 DNA是遗传物质的载体。在DNA水平，同一物种的不同个体间存在大量的变异。这些变异来自于碱基或染色体片段的插入或缺失，或来自于碱基的转换与颠换。自20世纪80年代以来，分子标记是随着分子遗传学研究的深入和DNA操作技术的发展，形成了以检测个体间DNA水平的变异为特征的一系列分子标记系统。与其他遗传标记相比，分子标记有以下优点：a 数量多，几乎无限。分子标记源于基因组的自发变异，广泛存在与自然界的各种生物中，应用上不受限制；b不存在同工酶标记所具有的组织、器官和发育时期特异性，易于实际使用； c 不受环境、季节等外界条件的影响，具有很高的准确性；d 许多分子标记表现为共显性，能区分纯和基因型和杂和基因型，可以提供完整的遗传信息； e 分子标记只是DNA系列片段，而不是具有功能的基因，故不存在非等位基因之间的互作等效应；f 分子标记一般无表型效应，对目标性状的表达不存在影响。DNA分子标记可以是一段功能未知的或不具有功能的DNA片段，但他必须在他相对应的等位位点上存在变异，这样才能作为按孟德尔方式遗传的标记。DNA分子标记也可以是一个有功能的基因。编码它的等位基因在DNA结构上的变异。 5.在染色体作图试验中，要注意哪些因素？ 答： 在染色体作图试验中要注意的因素有： (1)用于作图的位点在亲本中必须呈杂合状态，纯和状态的位点不能作为标记。只有这样，在其后代中才会产生重组基因型。（2）必须能够根据后代的表现型推断出所对应的基因型，最好能够反映出亲本的配子基因型。植物的测交后代表型直接反映了亲本的配子基因型。（3）群体要足够大，才能获得所需的重组类型。基因间距离越小，发生交换的可能性越小，获得重组型所要求的群体越大。(4)测其交换值和重组值；（5）遗传干涉和并发此外，当基因间的遗传距离很大时，除单交换外，还可能发生双交换，甚至发生双交换以上的多重交换，这势必会影响到染色体作图的精确性。因此，在遗传作图时，应利用尽可能多的遗传标记，增加相互连锁的密度。在染色体作图过程中，一般以最左端的基因位置为0，但随着研究的进展，发现有更左端的基因时，0点得位置让给新基因，其他基因相应移动。重组率在0%50%之间，但在遗传作图上，可以出现50个单位以上的图距。原因是这两个基因之间距离较远发生多次交换的缘故，所以从图上数值和重组率只限临近的基因座之间。 6.适合分子标记遗传作图的群体材料有哪些？如何创建？ 答：遗传连锁图是指以遗传标记(已知性状的基因或特定DNA序列)问重组频率为基础的染色体或基因位点的相对位置线性排列图。 要构建分子遗传图谱首先要根据遗传材料选择合适的作图群体，再应用分子标记技术对基因型进行标记分析，确定标记间的连锁关系。主要包括构建合适的遗传群体，包括亲本的选择，分离群体类型的选择及群体大小的确定等；利用合适的分子标记进行分析；利用计算机软件进行图谱构建，建立标记间的连锁排序和遗传距离； 利用计算机软件绘出遗传图谱这几个部分.构建连锁图谱是基于染色体的交换与重组上的。在细胞减数分裂时，非同源染色体上的基因相互独立自由组合，同源染色体上的基因产生交换与重组。位于同一染色体上的相邻基因在减数分裂过程中表现为基因连锁，如果同一条染色体上的两个基因相对距离越长，那么他们减数分裂发生重组的概率将越大，共同遗传的概率也就越小。因此可以根据他们后代性状的分离可以判断他们的交换率，也就可以判断他们在遗传图谱上的相对距离。一般用重组率来表示基因间的遗传距离，图距单位用厘摩（centi-Morgan,cM）表示，一个厘摩的大小相当于1%的重组率。 合适的作图群体是遗传作图的关键。用于遗传作图的群体可以分为两类：一类为暂时性分离群体，包括由单交组合产生的F2代或由其衍生的F3、F4家系，回交群体等，另一类是永久分离群体，如重组自交系群体和双单倍体适合分子标记遗传作图。目前，在大豆、松树、水稻、小麦、玉米、番茄、拟南芥、小白鼠、豌豆等众多动植物物种中都构建出了密度较高的遗传图谱。 1992 年Tanksley等学者利用栽培番茄L ycopersicon esculentum cvVF36OTm2a 与潘那利番茄L ycopsersicon pennelliiLA716 的F2 代群体建构出的番茄遗传图谱。这个图谱以RFLP 遗传标记为主并包含有同工酶和形态学等遗传标记,它包括遗传标记1 030 个,共占1 276 个图距单位,这个高密度的遗传图谱,大约每1. 2cM(厘摩)就有一个标记。使番茄的遗传图谱达到了一个新的水平。随着分子标记的不断发展,已报道了很多番茄分子遗传图谱的研究。利用栽培番茄与多毛番茄的BC1 群体制作了含142 个RFLP 标记、29 个抗病基因域(RGAs) 、总长度为1 469cM 的番茄分子遗传图谱,标记平均间距为8. 6cM 。Colwyn 等人在运用AFLP 标记构建番茄分子遗传连锁图谱时,利用分离群体和728 个引物,从42 000 个AFLP 片段中筛选出了3 个AFLP 标记,并将它们定位在番茄第1 条染色体的短臂上。在728 个引物中每个引物组合产生58 个AFLP 片段,33. 3 %具有多态性 。刘杨等人把一种在每序花数、始花节位和单果重等性状上存在显著差异的栽培番茄和野生醋栗番茄进行杂交,之后把产生的142 个F2 代单株作为作图群体,使用SSR 标记技术构建了一个番茄遗传连锁图谱,此图谱包含112 个标记,总长度为808. 4 cM,标记平均间距7. 22 cM 。番茄遗传图谱的构建在番茄基因组研究中起了非常重要作用,它可以为基因定位、基因克隆、基因组结构和功能的研究,和番茄的分子标记辅助育种打下良好的因此可以根据这两端的序列设计与核心序列互补的一对特异引物,通过PCR 扩增其间的核心微卫星DNA 序列,利用电泳分析不同基因型个体在每个SSR 位点上的多态性。 大豆： 利用所测定的近3万个EST序列，构建了含EST分子标记的遗传图谱；通过cDNA阵列分析，克隆了一个阳离子/质子反向转运蛋白基因GmCAX1和一个脱落酸激活的蛋白激酶基因GmAAPK，并对它们的功能进行了初步鉴定，这些结果为了解大豆耐逆机制提供了重要信息。 利用EST序列作为分子标记，结合已有的SSR标记和RFLP标记数据，构建了包含40个EST标记的大豆遗传图谱，被定位的EST标记分布于大豆连锁图谱中的14个连锁群。小麦育种工作的目的是实现品种改良，因此就必须对目的基因进行选择并实现优良基因的集成。通过构建高密度的遗传连锁图谱可以有效而快速地定位并克隆目的基因。首先在目标基因的侧翼得到连锁非常紧密的标记；然后由这些标记去筛选大片段DNA文库，鉴定出与标记有关的克隆，继之以亚克隆和染色体步移(Chromosome walking)含有目的基因的克隆片段，最终再辅之以转化和互补测验加以验证。邓志勇等用Qz 180铭贤169与Qz 180WL 1杂交后代F2代群体BSA分析，找到与Yrqz基因连锁遗传距离为34 cM和41 cM的AFLP标记 。张磊等将普通小麦细胞分裂素氧化P脱氢酶(CKX)基因定位在7 B、7 D染色体上，使用SSR分子标记做出微卫星标记连锁图。胡铁柱等利用SSR等分子标记分析，建立了小麦品种“唐麦4号”的一个抗白粉病基因PmTm 4的分子标记连锁图谱和物理图谱，并将该基因定位在小麦7BL染色体臂末端。张海全等利用SSR分子标记从粗山羊草Aegilops tauschii(Coss)Schma1Y 189中鉴定出1个显性抗小麦白粉病基因，应用分离群体分组法(BSA)筛选到Xgwm 58325 D、Xgwm 17425 D、Xgwm 18225 D和Xgwm 27125 D标记与该基因之间的遗传距离分别为257、167、91和70 cM，根据连锁标记所在小麦微卫星图谱的位置，将该基因定位在5DL染色体上。颜伟等对小麦抗梭条花叶病的研究得到了由66个SSR标记位点组成的l7个连锁群，涉及2 A、2 D、3 A、3 B、3 D、5 A、7 B、7 D等8条染色体并得出小麦2 D染色体上存在与小麦梭条花叶病抗性相关的位点。 7.简述分子标记遗传图谱的应用。答:分子标记（Molecular Markers）是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接的反映。与其他几种遗传标记形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相比，DNA分子标记具有的优越性有：大多数分子标记为共显性，对隐性的性状的选择十分便利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析；分子标记揭示来自DNA的变异；表现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简单、迅速。随着分子生物学技术的发展，现在DNA分子标记技术已有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。遗传图谱是某一物种的染色体图谱（也就是我们所知的连锁图谱），显示所知的基因和/或遗传标记的相对位置，而不是在每条染色体上特殊的物理位置。 通过遗传重组所得到的基因在具体染色体上线性排列图称为遗传连锁图。它是通过计算连锁的遗传标志之间的重组频率，确定他们的相对距离，一般用厘摩(cM，即每次减数分裂的重组频率为1%)来表示。绘制遗传连锁图的方法有很多，但是在DNA多态性技术未开发时，鉴定的连锁图很少，随着DNA多态性的开发，使得可利用的遗传标志数目迅速扩增。早期使用的多态性标志有RFLP(限制性酶切片段长度多态性)、RAPD(随机引物扩增多态性DNA)、AFLP(扩增片段长度多态性)；80年代后出现的有STR(短串联重复序列，又称微卫星)DNA遗传多态性分析和90年代发展的SNP(单个核苷酸的多态性)分析。理想的分子标记必须达以下几个要求：(1) 具有高的多态性；(2) 共显性遗传，即利用分子标记可鉴别二倍体中杂合和纯合基因型；(3) 能明确辨别等位基因；(4) 遍布整个基因组；(5) 除特殊位点的标记外，要求分子标记均匀分布于整个基因组；(6) 选择中性(即无基因多效性)；(7) 检测手段简单、快速(如实验程序易自动化)；(8) 开发成本和使用成本尽量低廉；(9) 在实验室内和实验室间重复性好(便于数据交换)。但是，目前发现的任何一种分子标记均不能满足以上所有要求。分子标记遗传图谱在以下方面的应用：动植物品种的遗传改良。传统的育种方法是根据表型对目标性状进行直接选择，但是由于基因间存在显性遮盖、上位性互作等效应，表型又直接受环境条件的影响和限制，选择效率低，周期长。通过分子遗传标记图谱，选择与目标性状紧密连锁的分子标记来进行相关选择即分子标记辅助选择，可以大幅度提高选择效率，缩短周期。分子标记辅助选择不存在受基因互作、环境条件等影响。此外，由于分子标记辅助选择是在DNA水平上进行，在植物苗期或动物幼期即可提取DNA进行筛选工作，节省了大量时间。打破不利连锁。在大多数植物基因中，1cM的DNA往往可能含有上百个基因，打破如此之小的DNA片段山的不利连锁通常需要回交20代以上。这是因为常规方法难以准确、有效地鉴定出重组个体，但通过与之紧密连锁的分子标记，就可以直接选择到发生在目的基因附近的重组个体。加快不同优良基因聚合的过程。根据遗传图谱，选择与不同优良目的基因紧密连锁的分子标记，利用4个优良基因A、B、C、D紧密连锁的分子标记，只需4个世代就可将它们聚集于一体。8.利用原位杂交作出的染色体图谱与分子标记遗传图谱有何不同？两者间有何联系？答：原位杂交作图是指DNA探针直接与染色体或染色体片段上对应的同源区段杂交结合，杂交结果直接显示出于探针序列同源的区域在染色体或染色体片段上所处的位置。原位杂交可以很直观地告诉我们某一序列在染色体上的位置与分布情况。为了直观的显示杂交结果，原位杂交使用的探针必须是被标记的。此外，使用原味杂交时，须打开维持染色体DNA双螺旋结构的碱基配对以使其形成单链分子（这称为DNA“变性”），只有这样，染色体DNA才能与单链DNA杂交。原位杂交技术的DNA探针可以用放射性同位素标记。但是放射性同位素限制了检测灵敏度和分辨率的同步提高，因为高灵敏度意味着放射性同位素必须具有高辐射能，但当辐射能提高后，会因为信号散射导致分辨率降低。原位杂交的DNA探针可以用克隆的DNA片段如物种专化性重复DNA序列或单拷贝，寡拷贝的DNA序列，也可用整个基因组的总DNA，后者被称为基因组原位杂交，主要用于检测远缘杂交后代中外源染色体导入情况。在染色体作图方面，尤其是将遗传 图谱转化成物理图谱的时候，原位杂交使用的探针则是克隆的DNA片段。分子标记和其他标记在遗传作图原理上是一致的。分子标记完全按孟德尔方式遗传。所不同的是，由于分子标记反映DNA分子水平上的变异，需要一定的实验技术手段才能被检测出来。在明确了某个分子标记与决定某个或某些性状的基因之间，或与其他分子标记之间的连锁关系之后，将分子标记标于遗传图中，并标明该分子标记与基因之间或与其他的分子标记之间的遗传距离，即得到分子标记遗传图谱。随着标记数目的不断增加，遗传图谱的密度将不断增大。分子标记遗传图谱是在明确了某个分子标记于决定某个或某些性状的基因之间、或与其他分子标记之间的连锁关系之后，将分子标记标于遗传图中，并标明该分子标记于基因中间或与其他分子之间的遗传距离。分子标记技术的发展和在实践中得应用已经显示出它的独特优势和使用价值。但是分子标记的使用只是一种技术手段，或者说是对经典的方法体系的完善。同样，分子标记技术也是在不断发展，而且也必须要发展，尤其在花费成本，技术要求，自动化操作，计算机软件分析等方面尚需作更大的进改进。高分辨率荧光原位杂交最初应用于人类染色体作图。荧光原位杂交技术已成为一种最直接分析DNA序列在染色体或DNA分子上排列的细胞与分子遗传学技术，他能有效地弥补遗传距离和物理距离间的偏差，已被广泛的应用于DNA分子物理图谱的构建和动植物基因结构的分析。两种作图都需要满足以下3个条件：1.)用于作图的位点在亲本中必须呈杂合状态。只有这样，在其后代中才会产生重组基因。2.)必须能够根据后代的表型推断出所对应的基因型，最好能够反映出亲本的配子基因型，植物的测交后代表型直接反映了亲本的配子基因型。3.)群体要足够大，才能获得所需的重组类型。基因间距离越小，发生交换的可能性越少，获得重组型所要求的群体越大。9.请参阅有关资料，了解DNA分子标记与原位杂交技术发展的最新进展。答：DNA分子标记的进展：遗传标记经历了形态标记、细胞学标记、生化标记和DNA分子标记四个发展阶段。前三种标记都是以基因表达的结果为基础的，是对基因的间接反映；而DNA分子标记则是DNA水平遗传变异的直接反映，它具有能对各个发育时期的个体、各个组织、器官甚至细胞作出“中性”以及操作简便等特点。正是这些特点，奠定了它极其广泛的应用基础。DNA分子标记本质上是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异特DNA片段。DNA分子标记大多以电泳谱带的形式表现生物个体之间DNA差异，通常也称为DNA的指纹图谱。在过去10多年中，分子标记技术得到了突飞猛进的发展，至今已有几十种分子标记技术相继出现，并在基因库构建、基因克隆、基因组作图、基因定位、作物遗传育种、植物亲缘关系鉴别等各个研究领域得到了广泛的应用。1第一代分子标记1.1 RFLP标记技术 1980年Botesin提出的限制性片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphisms ，RFLP)可以作为遗传标记，开创了直接应用DNA多态性的新阶段，是最早应用的分子标记技术。RFLP是检测DNA在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小，反映DNA分子上不同酶切位点的分布情况，因此DNA序列上的微小变化，甚至1个核苷酸的变化，也能引起限制性内切酶切点的丢失或产生，导致酶切片段长度的变化。RFLP标记的等位基因具有共显性的特点，结果稳定可靠，重复性好，特别适应于构建遗传连锁图。但是，在进行RFLP分析时，需要该位点的DNA片段做探针，用放射性同位素及核酸杂交技术，既不安全又不易自动化。另外，RFLP对DNA多态性检出的灵敏度不高，RFLP连锁图上还有很多大的空间区。 1.2 RAPD标记技术 为了克服RFLP技术上的缺点，Williams等于1990年建立了随机扩增多态DNA(Randomamplified polymorphic DNA ，RAPD)技术，由于其独特的检测DNA多态性的方式使得RAPD技术很快渗透于基因研究的各个领域。RAPD是建立于PCR基础之上的分子标记技术，基本原理是利用一个随机引物(810个碱基)通过PCR反应非定点地扩增DNA片段，然后用凝胶电泳分离扩增片段来进行DNA多态性研究。对任一特定引物而言，它在基因组DNA序列上有其特定的结合位点，一旦基因组在这些区域发生DNA片段插入、缺失或碱基突变，就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化，从而导致扩增产物的数量和大小发生改变，表现出多态性。与RFLP相比，RAPD技术简单，检测速度快，DNA用量少，实验设备简单，不需DNA探针，设计引物也不需要预先克隆标记或进行序列分析，不依赖于种属特异性和基因组的结构，合成一套引物可以用于不同生物基因组分析，用一个引物就可扩增出许多片段，而且不需要同位素，安全性好。当然，RAPD技术受许多因素影响，实验的稳定性和重复性差，首先是显性遗传，不能识别杂合子位点，这使得遗传分析相对复杂，在基因定位、作连锁遗传图时，会因显性遮盖作用而使计算位点间遗传距离的准确性下降;其次，RAPD对反应条件相当敏感，包括模板浓度、Mg2+浓度，所以实验的重复性差。 1.3 AFLP标记技术 扩增片段长度多态技术(AFLP)，又名限制片段选择扩增技术(Selective restriction fragment amplifi2cation ，SRFA)，于1993年由荷兰KEYGENE公司的Zabean和Vos等发明，并已申请专利。AFLP是近年来迅速发展起来的一种分子标记技术，它将基因组DNA用成对的限制性内切酶双酶切后产生的片段用接头(与酶切位点互补)连接起来，并通过5端与接头互补的半特异性引物扩增得到大量DNA片段，从而形成指纹图谱的分子标记技术。AFLP指纹呈孟德尔式共显性和显隐性遗传。它兼具RAPD与RFLP的优点，有较高的稳定性，用少量的选择性引物能在较短时间内检测到大量位点，并且每对引物所检测到的多个位点都或多或少地随机分布在多条染色体上，各染色体上AFLP标记的数目与染色体长度呈正相关(r=0.501)，而一对引物获得的标记涉及的染色体数与标记数呈正相关(r=0.826)。因此，通过少量效率高的引物组合，可获得覆盖整个基因组的AFLP标记。目前，AFLP作为一种高效的指纹技术，已在遗传育种研究中发挥它的优势。不过也有研究认为，AFLP对基因组纯度和反应条件要求较高，另外用于遗传作图时，少数的标记与图谱紧密度有出入。此外，在RAPD和RFLP技术基础上建立了SCAR(Sequence characterizedamplified regions ，序列特异性扩增区域)、CAPS(Cleaved ampli2fied polymorphic sequence ，酶切扩增多态序列)和DAF(DNA amplified fingerprints ，DNA扩增指纹)等标记技术。这些技术的出现，进一步丰富、完善了第1代分子标记技术，增加了人们对DNA多态性的研究手段。 2第二代分子标记2.1 SSR标记技术 在真核生物基因组中存在许多非编码的重复序列，如重复单位长度在1565个核苷酸的小卫星DNA(Minisatellite DNA)，重复单位长度在26个核苷酸的微卫星DNA(Microsatellite DNA)。小卫星和微卫星DNA分布于整个基因组的不同位点。由于重复单位的大小和序列不同以及拷贝数不同，从而构成丰富的长度多态性。Moore等于1991年结合PCR技术创立了SSR(Simple sequence repeat，简单重复序列)标记技术。SSR也称微卫星DNA，是一类由几个(多为15个)碱基组成的基序串联重复而成的DNA序列，其中最常见的是双核苷酸重复，即(CA)n和(TG)n，每个微卫星DNA的核心序列结构相同，重复单位数目1060个，其高度多态性主要来源于串联数目的不同。不同遗传材料重复次数不同，导致了SSR 长度的高度变异性，这一变异性正是SSR标记产生的基础。SSR标记的基本原理是根据微卫星重复序列两端的特定短序列设计引物，通过PCR反应扩增微卫星片段。由于核心序列重复数目不同，因而扩增出不同长度的PCR产物，这是检测DNA多态性的一种有效方法。微卫星序列在群体中通常具有很高的多态性，而且一般为共显性，因此是一类很好的分子标记。 2.2 ISSR 标记技术 ISSR即内部简单重复序列，是一种新兴的分子标记技术。1994年Zietkiewicz等对SSR技术进行了发展，建立了加锚微卫星寡核苷(Anchored-microsatellite-oligonucleotides)技术。他们用加锚定的微卫星寡核苷酸作引物，即在SSR的5端或3端加上24个随机选择的核苷酸，这可引起特定位点退火，从而导致与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间的基因组节段进行PCR扩增。这类标记又被称为ISSR(Inter simple sequence repeat)、ASSR(Anchored simple sequence repeats)或AMP PCR。在所用的两翼引物中，可以一个是ASSR引物，另一个是随机引物。如果一个是5端加锚的ASSR引物，另一个是随机引物，则被称为RAMP技术。 3.第三代分子标记3.1 SNP标记技术 单核苷酸多态性(Single nucleotidepolymorphism，SNP)被称为第3代DNA分子标记，是指同一位点的不同等位基因之间个别核苷酸的差异，这种差异包括单个碱基的缺失或插入，更常见的