第六讲 典型生物催化的反应-氧化还原反应.ppt

还原酶主要包括三种酶：1 .脱氢酶)2。氧化酶)3。氧化酶)，1。根据底物的取代方式，脱氢酶广泛用于还原羰基，如醛或酮和碳=碳键。这两种反应都是从潜在的具有不对称电势的手性底物中产生手性产物。反向过程(反应)，如醇的氧化或脱氢，通常伴随着手性中心的破坏，从而限制了其应用。脱氢酶催化的还原反应，辅酶的再生，氧化还原酶的催化特性。氧化还原酶要求氧化还原酶在还原(或氧化)反应中提供(或接受)化学平衡物质。辅酶NAD (H): 80% NADP (H): 10%黄素(FMN，FAD)和吡咯喹啉醌(PQQ)的类型相对较小。辅酶具有以下特点：1 .这个分子相对不稳定。辅酶仅在昂贵的(化学计量)反应中改变其氧化还原状态。因此，它可以通过另一个氧化还原反应原位再生。为了降低成本，需要添加辅酶的催化测定。TTN的总转化数(Totalturnovernumber)是辅酶再利用性能的表征，代表循环过程的效率，即在一个完整的反应过程中，每摩尔辅酶可产生的产品的总摩尔数。辅酶分子会在循环过程中被破坏。一般TTN需要达到103 104，大规模生产最好达到105。辅酶的价格，应用还原反应技术(大规模反应)的“瓶颈”理解问题深入研究解决问题当完整的微生物细胞用于作用于生物催化剂时，辅酶再生不再是关键问题。微生物包含代谢过程中所需的所有酶和辅酶。辅酶可以通过添加廉价易得的氧化还原平衡物质如糖类来再生。还原型镍酰胺辅酶再生，1。非酶化学还原，如Na2S2O4tn 100，简单，由于na 2s2 o 4，2导致的低效率酶失活。电化学和光化学再生的优点：价格低廉，使用方便缺点：反应区控制差，多副反应TTN10003，高效的酶法还原NADH和NADPH，复杂，成本高，酶法还原再生，底物偶联法，方法：辅酶再生是通过加入一个供体，在相同酶的作用下反方向反应。为了使反应平衡朝着期望的方向进行，供体通常过量，TTN103。缺点：1。增加产品纯化难度2。加入供体可能导致酶3失活。高浓度辅助底物。当引起衬底抑制时，可以考虑气体膜等用于反应和分离耦合。酶偶联法。方法：两个平行的氧化还原反应分别通过两种不同的酶催化主底物和辅酶再生的转化过程。特征：这两种酶对各自的底物具有足够的特异性，因此这两种酶反应可以独立进行。所有底物和辅助底物都不争夺某一酶的活性中心，因此反应效率高，需要加入另一种酶进行独立转化。NADH有一些很好的再生方法，已经得到了广泛的应用，并且各有优缺点。NADPH仅在实验室规模上再生，并且需要开始大规模生产的廉价且有效的方法。FDH法：NADH的再生，酶：甲酸氢酶。优点：1。辅助底物和副产物对酶2没有抑制作用。辅助底物和副产物易于从产物3中分离。FDH有商业酶供应，容易固定，缺点稳定：FDH价格昂贵。固定化低比活性FDH(3U/mg)可以解决上述问题。最广泛使用的再生NADH的方法是TTN: 103 105，但不能用于NADPH的再生。葡萄糖脱氢酶法：NAD(P)H的再生，酶：GDH(葡萄糖脱氢酶)。特点：从杆菌中提取的GDH是稳定的。高比活性的缺点：1。GDH很贵；2.产品分离很困难。如果不考虑纯化，这种方法在实验室中的应用是一种非常好的方法，也是再生NAD(P)+的最简单的方法之一。G6PDH还可以在相同的反应体系中从肠膜明串珠菌肠链球菌中提取酶，该方法廉价、稳定，可以用NAD (P)作为底物。然而，酵母中的G6PDH仅被认为是NADP底物的缺点：G6P价格昂贵。解决办法是用己糖激酶通过酶法制备葡萄糖，但它也涉及三磷酸腺苷的再生。从酿酒酵母中提取的6-硫酸-葡萄糖和G6PDH可用于再生NADPH。硫酸不作为酸催化剂来水解NADPH，底物比磷酸盐更容易制备。作为葡萄糖/GDH法的补充，它是再生NADH和NADPH的较好方法。在乙醇脱氢酶和乙醇脱氢酶法中，NADHL。肠系膜液：乙醇脱氢酶酵母中的NADPH。广泛用于NADH和NADPH的再生。优点：1。多动症的价格适中。2.乙醇和乙醛有挥发性的缺点。1.只有具有活性羰基的醛或环酮具有较高的底部产物收率。对于其他底物，必须加入过量的(乙)醇或(乙)醛必须连续除去。方法：通入氮气去除乙醛，将乙醛转化为乙酸。2.低TTN 3。复杂和不稳定的多酶系统。低浓度的乙醇和乙醛会抑制酶的活性或导致酶失活。氢化酶直接使用分子氢作为供体来再生NADH。优点：1。强还原性2。对酶和辅酶3无损害。无副产品缺点：1。对氧化敏感。没有商业酶3。复杂的发酵准备工作。氧化烟酰胺辅酶，优选最广泛使用的NAD (P)的再生方法，是由谷氨酸脱氢酶催化的-酮戊二酸、谷氨酸脱氢酶(谷氨酸脱氢酶)生成L-谷氨酸的反应。NADH和NAD(P)+可作为辅酶-酮己二酸的底物，产物为L-氨基二酸。丙酮酸和乳酸脱氢酶具有再生NAD :1的优点。低密度脂蛋白胆固醇价格更便宜。乳酸脱氢酶比活性高，比葡萄糖脱氢酶高。缺点：氧化还原电位较低，NADP+、乙醛和乙醛脱氢酶不能再生。再生NAD+TTN的缺点在103和104之间。酶失活的缺点：1。酵母醛脱氢酶价格更便宜。试剂是挥发性的。醛和酮被酶还原，许多酮可以被脱氢酶立体选择性地还原，得到手性仲醇产物，可以是S-醇或R-醇Prelog规则：根据底物空间结构的需要确定的立体化学反应过程可以用一个简单的模型Prelog规则来判断。大多数商业脱氢酶和大多数微生物在进行酮的立体专一性还原以获得产物S-醇时遵循预记录规则(如YADH、HLADH)。预记录规则图显示了各种脱氢酶的底物范围。酵母醇脱氢酶的底物特异性范围很窄。通常，醛和甲基酮是唯一的底物。碳链长于一个甲基的酮不能用作底物。不是由商业酶提供的其他多动症应用是有限的。HLADH是一种常见的酶，具有广泛的底物特异性和良好的立体特异性。因此，它是生物转化中最广泛使用的脱氢酶。HLADH由两种几乎相同的酶组成。钻形二聚体的x射线衍射温度超过10的旋风分离器不容易用作基底。当无环酮被还原时，对映选择性低。HLADH分离双环酮和多环酮。含氮杂环酮使酶失活，并与含锌活性中心反应。HLADH以100%的转化率催化2-烷基硫代吡喃-4-酮的还原，其以非对映选择性方式进行，以获得顺式和反式-S-醇的混合物。后者经色谱分离后可被氧化，得到高光学纯度的酮。HLADH催化的非对映体还原、潜在手性萘二酮的选择性还原、YADH和HLADH不能用于开环酮的不对称还原，而TBADH可以还原开环甲基、乙基酮、-卤代烷基、甲基或带有杂环取代基的三氟乙基酮得到相应的仲醇，具有高立体选择性的，-不饱和酮和取代基大于乙基的酮不能用作底物。对映体选择性还原酮，对映体遵循预log规则，得到小分子底物的S-醇和R-醇。磷酸三丁酯最大的缺点是辅酶NAD(H) v可以代替NAD(H)V，需要NADP(H)，NAD(H)和无机钒酸盐(HVO42-)在溶液中合成。添加钒酸盐引起的副反应被咪唑缓冲体系抑制。羟基类固醇脱氢酶适用于将大的单环和双环酮的天然底物还原为类固醇化合物。相似的空间结构产物可以用Prelog规则来判断，小分子底物也可以减少，但选择性相对较差。从上述酶中选择合适的脱氢酶可以将各种化学合成的酮转化成相应的手性仲醇。以NADH为辅酶的乳酸脱氢酶可将-酮酸还原为r型或s型羟基酸甘油脱氢酶(GDH)，该酶已商品化。可用于-羟基酮嗜热微生物的立体选择性还原研究：酶的稳定性好，温度对反应选择性的影响大，可以选择：完整细胞对醛和酮的还原不同于纯酶的还原，利用完整细胞不需要昂贵的辅酶循环，具有以下优点：1 .它含有多种可以使用非天然物质作为底物的脱氢酶2，含有所有必需的辅酶3，含有辅酶再生的代谢过程4，可以使用廉价的碳源作为辅助底物5，具有良好的辅酶和酶稳定性，并具有以下缺点：1。由于非天然底物浓度低(约0.1-0.3%)，所以生产效率低。很难回收产物，尤其是胞内产物3和碳源，它们产生大量副产物。少量用于辅酶再生4，反应特异性变化大5，微生物菌株特异性强，重复实验结果困难。对于：类作业，请描述酶法制备S-2-氯丙酸和联产S-乳酸中使用的原料和酶的名称，以及微生物还原选择性差的原因。只有一种氧化还原酶催化还原反应，但手性识别能力不高。两种或多种氧化还原酶可以减少底物的不同异构体。所选竞争反应的选择性取决于各反应的相对反应速率、米氏方程、Vmax/Ks、提高微生物还原反应选择性的方法、加入反应后可去除的保护基修饰底物、通过固定化技术改变代谢参数、不同生长阶段的细胞改变发酵条件、筛选更好的微生物选择性抑制竞争酶的酶活性、酵母细胞还原醛酮， 面包酵母或酿酒酵母是最广泛用于不对称还原酮的微生物，来源广泛，不需要无菌发酵，长期以来对生物转化的设备要求较低，可作为简单脂肪醇和芳香醇按照Prelog规则还原得到S-醇的参考。 除了长链甲基酮，其他长链酮不能用作底物。带有氯、溴、氟、硝基、羟基和甲硅烷基的酮也可以用作底物。脂肪族-酮酯被酵母还原生成-羟基酯。反应差异的原因不是单个酶的底物选择性根据底物的结构而变化。主要是一系列不同的脱氢酶竞争同一个底物，因此具有不同立体选择性的D-特异性酶(属于脂肪酸复合酶系统)对短链醇基底物具有更强的亲和力。例如，甲酯L-特异性酶对长链醇基的底物如辛基酯具有更大的亲和力，因此可以通过仔细设计底物来调节对竞争性酶之一的选择性选择性选择性抑制，如固定化、选择性抑制L-型酶、选择性抑制d-型酶、酵母还原-单取代-酮酸酯，以及还原后顺式/反式-羟基酯顺式/反式1:1。由烯醇化引起的快速原位外消旋非对映体选择性由酶的立体选择性决定。当取代基小时，主要是顺式(Syn)取代基大，主要是反式(ANTI)。2R、3R-Syn和2S、3R-anti从A3360获得。羰基还原产生的仲醇的手性遵循Prelog规则模型预测：非对映体选择性1，-取代基小于羧基部分，进入-取代基大于羧基部分，进入L2，酵母中有各种脱氢酶，当各种可能的非对映体产物的-取代基为羟基、硫代烷基、叠氮基、乙酰胺基或-位完全取代时，不利于烯醇异构化，不能原位外消旋化，还原环状-酮酸酯，根据上述模型，可以推测酵母可以将-环状酮还原为原因是环结构的刚性阻止了，-碳键的旋转，因此环酮还原反应的对映选择性高于非环酮。硫被引入到环状结构中，在生物转化为incr后被除去因此，这里可以取代取代基以避免这种副反应。Cis产品在小环中占主导地位。当具有高光学纯度的环变大时，立体选择性难以预测，产率将降低。酵母也可用于还原带有硝基、氟、硫和杂环的功能化合物，以及还原金属有机化合物。产品通常是许多成功的S-醇的例子。在一些工业化国家，除酵母外，当酵母催化的反应的立体选择性低或生成的产物与所需的构型相反时，可以考虑用其他微生物进行催化和无环-二酮还原。为了生产二醇，先将空间位阻较小的羰基还原成S-羟基酮(Prelog法则)，再将空间位阻较大的酮进一步还原成二醇。主要产物是反式二醇，完全细胞还原C=C键，酶立体选择性催化还原潜在的手性C=C双键具有很高的特异性，可用于多种底物。一般来说，这是一种传统化学方法难以实现的酶：在许多微生物中发现了NAdh-辅酶烯酸还原酶，如梭状芽胞杆菌、变形杆菌。和酵母。已经分离、纯化和鉴定了烯酸还原酶。由于辅酶再生的问题，制备性生物转化仍然使用完整的细胞。同时，烯酸还原酶是对微量氧敏感的酶反应的立体化学过程：碳=碳双键上的氢反式加成(植物细胞中的顺式加成)，酵母细胞不对称地减少碳=碳双键。1934年发现面包酵母可以不对称地减少碳=碳，这为面包酵母不对称地减少碳=碳建立了一套规则。有时它可以用于其他微生物。碳=碳只有在被吸电子取代基活化后才能被还原。对于不能被单个碳=碳和碳-碳三键还原的特定活化基团，参见以下具体实施例。对于，-不饱和碳酸和酯的还原，产物的绝对构型可由顺式-反式异构体(E，Z)决定，以控制酯水解成相应的酸，然后，-不饱和内酯的还原也可用作还原底物。该产品是还原的R型，不饱和内酯，-不饱和醛。首先，碳=碳被烯烃还原酶还原生成饱和醛，饱和醛被脱氢酶还原得到手性链烷醇烯丙醇，它也可以作为底物。共轭二烯中只有，双键被选择性还原，-不饱和酮被还原。碳=碳首先被还原得到饱和酮，然后被脱氢酶还原生成手性仲醇。有时，被吸电子基团活化的不饱和酮首先被还原。，-不饱和硝基化合物可以转化为手性硝基烷烃，但光学纯度不高。全细胞系统辅酶再生技术可避免辅助底物产物的不必要代谢物，提高作为电子