聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGEppt课件

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质相对分子质量,1,概述,1967年由Shapiro建立。1969年由Weber和Osborn进一步完善。他们发现样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂（SDS）以后,蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小,电荷因素可以忽视。,2,实验原理,3,4,5,SDS是变性剂，它能破裂蛋白质分子中的氢键和疏水作用，去多肽折叠。巯基乙醇或DTT是还原剂，能打开二硫键，因此使蛋白质分子处于伸展状态。此时SDS以其烃链与蛋白质分子的侧链结合成复合物，大约每两个氨基酸残基结合一个SDS分子。,基本原理,6,导致：1、由于SDS是阴离子，使多肽表面覆盖的负电荷远远超过蛋白质分子原有的电荷量，消除了原来的电荷差异。2、改变了蛋白质单体分子的构象，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都相同，长轴长度随其分子量的大小成正比变化。这样的蛋白质-SDS复合物，在凝胶电泳中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只是椭圆棒的长度也就是蛋白质分子量的函数。,7,当蛋白质的分子量间时，蛋白质-SDS复合物的电泳迁移率与蛋白质分子量的对数呈线性关系，符合下列方程：,常数斜率迁移率,通过已知分子量的蛋白与未知蛋白的比较，就可以得出未知蛋白的分子量。,8,注意事项,1.SDS的纯度：市售SDS(A.R.)需重结晶后再用。2.SDS与蛋白质的结合量：大多数1.4gSDS/g蛋白质影响蛋白质和SDS结合的因素主要有以下3个：(1)溶液中SDS单体的浓度(2)样品缓冲液的离子强度(3)二硫键是否完全被还原3.凝胶浓度：应根据位置样品估计相对分子质量，选择适当的凝胶浓度。测定蛋白质相对分子量时，必须同时作标准曲线，不能利用这次的标准曲线作为下次用。,9,4.多亚基蛋白的分子量：有许多蛋白质，是由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（如-胰凝乳蛋白酶）组成的，SDS-PAGE测定的只是它们的亚基或单条肽链的分子量，而不是完整分子的分子量。5.特殊蛋白质的相对分子质量：不是所有的蛋白质都能用SDS-PAGE测定其分子量。包括：电荷异常或构象异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质（如某些糖蛋白）以及一些结构蛋白如胶原蛋白等。6.对样品的要求：应采纳低离子强度的样品。,10,SDS-PAGE分类,SDS-PAGE按照缓冲液pH值和凝胶孔径差异分为连续系统和不连续系统两大类：连续系统：由电极缓冲液和分离胶组成。电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统：由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度均不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。,11,12,实验过程,凝胶制备,样品处理与加样,电泳,剥胶与固定,染色与脱色,安装电泳槽,13,实验步骤,一、制胶1.配胶配胶应根据所测蛋白质相对分子质量范围选择适宜的分离胶浓度。由于SDS-PAGE有连续体系和不连续体系两种，两者各有不同缓冲体系，因而有不同的配制方法。（以不连续体系为例）,14,15,2.分离胶的制备胶灌至距梳子齿下端1cm灌毕封上一层水加速聚合当胶与水出现清晰界限时表明聚合好。3.浓缩胶的制备用滤纸吸干水倒入浓缩胶插入梳子静置，聚合。,16,二、样品处理与加样1.样品处理2.加样小心拔出梳子上下槽注入电极缓冲液用微量进样器点样三、电泳接上电泳仪，上槽为负极，下槽为正极。打开开关，保持恒压进行电泳。,样品溶解沸水浴冷却,加样,样品迁移方向,样品溶解液,17,电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。,不同分子量的蛋白质在凝胶中运动示意图,混合样品,带孔胶,按分子大小分离,电泳方向,电泳,小分子,大分子,18,流程图,19,结果分析,1.相对迁移率的计算,相对迁移率mR=,蛋白质样品距加样端迁移距离(cm)溴酚蓝区带中心距加样端距离(cm),标准蛋白在SDS-凝胶上的示意图,20,2.标准曲线的绘制,以每条Marker带的相对迁移率为横坐标，相应分子量的对数值为纵坐标，绘制标准曲线。如图,21,3.未知蛋白质样品分子量的测算,计算未知蛋白质样品的相对迁移率，在标准曲线上找到对应的纵坐标，即可得该样品的分子量。如图,22,在一定的凝胶浓度下，多肽链分子量的对数与多肽链的相对迁移率成线性关系，所以可以通过标准曲线求未知多肽链分子量。,标准蛋白分子量,未知蛋白,相对迁移率,SDS-PAGE测定蛋白质分子量示意图,23,Native-PAGE和SDS-PAGE的比较,与变性凝胶电泳最大的区别就在于蛋白在电泳过程中和电泳后都不会变性。最主要的有以下几点：1.凝胶的配置中非变性凝胶不能加入SDS，而变性凝胶有SDS。2.样品缓冲液中非变性凝胶不仅没有SDS，也没有巯基乙醇。3.在非变性凝胶中蛋白质的分离取决于它所带的电荷以及分子大小，而SDS-PAGE电泳中蛋白质分离只与其分子量有关。,24,4.非变性凝胶电泳中，酸性蛋白和碱性蛋白的分离是完全不同的，而SD