胚胎冷冻保存ppt课件

胚胎冷冻保存，1。胚胎在-196超低温下长期保存。这是20世纪70年代成功测试的新技术，也是胚胎移植技术的重大突破。一、胚胎冷冻保存的基本概念，2、胚胎冷冻保存的意义，胚胎移植不受时间和地点的限制，提高胚胎移植技术的效率；长期保存优良奶牛基因最可靠的技术措施；促进国际交流；取代引进繁殖动物。渗透性：甘油、乙二醇、丙二醇、二甲基亚砜等。以防止溶质效应。(2)不渗透性：蔗糖、海藻糖、聚乙二醇、聚维酮和多糖等。降低胚胎外液体的冰点，减少胚胎外冰晶的形成，并促进胚胎内水的流出，从而最终减少胚胎内冰晶的形成。基础流体：多相流量计(改良)、TCM-199、PBS、HEPES等。最常用的是多氯联苯。防冻剂的种类和功能，特点：分子量小于100，易于渗透，特点：分子量大，不进入细胞。玻璃化的概念：玻璃化是一种物理现象，是指在冰晶形成的阶段，通过快速冷却而没有结晶的固化，从而使溶液形成稳定的具有不规则结构的玻璃状固体，并保持液态的正常分子和离子分布，使胚胎细胞不受损伤。也就是说，高浓度的防冻剂，在快速冷却后，液体的粘度增加，冰晶无法形成，从液态变成透明的半固态。玻璃化溶液(VS):细胞内液体防冻剂：这种防冻剂被称为细胞内液体防冻剂，因为它分子量小，容易透过细胞膜，使其内部迅速达到玻璃化所需的浓度。如二甲基亚砜、甘油、丙二醇、乙酰胺、乙二醇等。胞外液体防冻剂：这种防冻剂分子量大，一般难以穿透细胞膜，因此被称为胞外液体防冻剂。如聚乙二醇、蔗糖、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、海藻糖、牛血清白蛋白等。将上述两种防冻剂混合后，用碱性液体多孔炭制备各种玻璃化溶液。(1)结晶变化：当温度降至冰点时，冰晶首先在胚胎外的液体中形成。温度、冰晶的溶质浓度和外部液体迫使胚胎内的水不断流出，胚胎内的溶质浓度增加。(2)溶质效应：冷却速度太慢，胚胎中的水完全流出，溶质浓度极度增加，细胞膜的脂蛋白复合物和细胞质中的其他一些功能蛋白变性，对胚胎造成不可逆的损害。(3)机械效应：冷却速度过快，胚胎内部的水不能溢出到胚胎外部，直接在胚胎内部形成冰晶，对胚胎造成致命的机械损伤。胚胎冷冻保存过程中的变化与损伤。(1)常规冷冻法：控制“植冰”后的冷却速度，避免过快，以免在胚胎内形成大冰晶；避免太慢，以免胚胎脱水造成溶质效应。超速冷冻法：浸入式防冻液在冷冻前将胚胎脱水，平衡一段时间，然后放入液氮中保存。(3)玻璃化冷冻法：应用高浓度防冻剂，使胚胎内外液同源晶核的形成温度基本接近玻璃化转变温度，控制防冻剂和胚胎的平衡时间和温度，使防冻剂对胚胎的毒性降至最低。胚胎内外液可迅速转化成玻璃体，直接放入液氮中保存。胚胎冷冻保存方法，7，历史：1972年首次成功获得小鼠胚胎冷冻保存；1973年，牛胚胎被成功冷冻并产下后代。操作步骤：(1)防冻液平衡：在室温(20 25)下，在含1 2 mol/l防冻剂的磷酸盐缓冲液(PBS)中，胚胎平衡10分钟，使细胞内防冻剂浓度基本达到饱和。传统自由将胚胎移植到一个0.25毫升的塑料细管中，预先准备好防冻液，密封并冷却。当温度降至-6左右时，上述方法会导致结冰。(3)自动冷却仪中的缓慢冷却：种植冰后的细管以一定的速度缓慢冷却。当温度以0.33/分钟降至-30 35时，加入液氮；当速度以1.0/分钟降至-80时加入液氮；当温度以0.5/分钟降至-30至-35时，加入液氮。原理：种植冰后，细胞外液的浓度会相对增加，这将促进细胞内水分的充分清除。因此，缓慢冷却是非常必要的。由于脱水，细胞内部完全收缩，同时防冻剂渗入细胞内部，增加内部溶液的粘度。此时，它被放入液态氮中，液态氮由于过冷而抑制冰晶的形成。(4)解冻：取出储存在液氮中的塑料细管后，迅速浸入室温或37水浴中解冻。(5)防冻剂的去除：原因是未冷冻的胚胎在细胞内具有高浓度的防冻剂，这对胚胎是有毒的。此外，如果直接转移到等渗生理溶液中，水将延伸到细胞中，导致细胞膨胀和损伤。防冻液：蔗糖溶液；操作：将解冻的胚胎从高浓度防冻液转移到低浓度防冻液中进行梯度稀释。也就是说，先将胚胎转移到高渗蔗糖溶液中，再转移到低渗蔗糖溶液中，脱水时除去防冻剂，然后转移到等渗生理溶液中清洗，待胚胎基本恢复后再转移或继续培养。常规冷冻法。将胎儿从培养液中吸出并放入冷冻溶液中。将：1.5毫升乙二醇蔗糖聚对苯二甲酸丁二醇酯装入细管(事先准备好编号)中，放入冷冻容器中-6.0，每分钟下降0.5，放入液氮容器中至-30。常规冷冻程序，12。玻璃化的概念：它是一种物理现象。这意味着，如果溶液形成稳定的具有不规则结构的玻璃样固体，并通过快速冷却和凝固而不结晶，在液态下保持正常的分子和离子分布，胚胎细胞将不会受到损伤。也就是说，高浓度的防冻剂，在快速冷却后，液体的粘度增加，冰晶无法形成，从液态变成透明的半固态。玻璃化溶液(VS):细胞内液体防冻剂：这种防冻剂被称为细胞内液体防冻剂，因为它分子量小，容易透过细胞膜，使其内部迅速达到玻璃化所需的浓度。如二甲基亚砜、甘油、丙二醇、乙酰胺、乙二醇等。胞外液体防冻剂：这种防冻剂分子量大，一般难以穿透细胞膜，因此被称为胞外液体防冻剂。如聚乙二醇、蔗糖、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、海藻糖、牛血清白蛋白等。将上述两种防冻剂混合后，用碱性液体多孔炭制备各种玻璃化溶液。胚胎玻璃化，13，几种常见的玻璃化方法：(1)Rall等人(1985)玻璃化冷冻保存法：它是玻璃化冷冻保存法最初发明的。他们采用的VS1玻璃化溶液是以二甲基亚砜(DMSO)为主溶液，加入乙酰胺(AA)、丙二醇(PG)和不渗透防冻剂聚乙二醇(PEG)以减轻其化学毒性。聚乙二醇能促进玻璃化。当胚胎在玻璃化溶液中平衡时，浓度由低到高(25% 50% 100% VS1)；平衡温度由高到低(22 4 -4)分三步完成，平衡35分钟后放入液氮中冷冻保存。胚胎玻璃化，14，(2)Scheffen等玻璃化冷冻保存方法：主要防冻剂：甘油(g)和丙二醇(p)；玻璃化溶液：上述两种防冻剂各混合25%(PG25)。混合后，溶液的化学毒性可以在不添加细胞不渗透防冻剂的情况下降低。方法：室温(20 25)(3) Kasai等玻璃化冷冻保存方法：防冻剂：乙二醇(EG)是一种细胞内液体防冻剂(渗透性保护剂)，具有分子量小、溶液渗透压高、细胞膜渗透性强的特点。蔗糖是细胞外液的防冻剂，有利于促进玻璃化形成。蔗糖用于在冷冻前使胚胎细胞脱水，调节细胞中的乙二醇，并在解冻后除去乙二醇。玻璃化溶液：上述三种防冻剂由多相流量计调节至EFS玻璃化溶液；方法：在EFS玻璃化溶液中平衡室温胚胎2 5分钟后，注入液氮。胚胎玻璃化，16，(2)朱等玻璃化冷冻保存方法：主要防冻剂：乙二醇、甘油和二甲基亚砜；玻璃化溶液：EFS、玻璃纤维增强塑料和EDFS；方法：在室温下，胚胎在10%乙二醇或10%甘油或10%乙二醇10%二甲基亚砜中平衡5分钟，然后转移到EFS或GFS或EDFS玻璃化溶液中30秒，即两步冷冻保存。该方法重复性高，可用于实验动物和各种家畜的胚胎冷冻保存。胚胎玻璃化，17，胚胎小管数，胚胎小管数，18，胚胎管，19，保护细胞膜免受损伤；保护胚胎细胞免受晶体损伤；具有“渗透活性”；解冻后，必须从细胞中去除保护剂。甘油：普通的冷冻和解冻剂，缓慢扩散通过细胞膜，必须缓慢去除，以避免渗透休克；乙二醇：直接胚胎移植法，通过细胞膜快速扩散，因此不需要缓慢移除。冷冻保存要点，20，胚胎解冻，解冻方法：缓慢解冻：以4-25/分钟的速度将胚胎从冷冻保存逐渐升温至室温，适用于缓慢冷冻的胚胎。当温度从-196上升到-50 -15时，细胞内仍可能形成大冰晶，杀死胚胎。快速解冻：温水浴法，让胚胎以300-360/分钟的速