第9章 发酵产物的提取与分离PPT课件

第九章发酵产物的提取和纯化，发酵液下游处理是指从发酵产物中分离纯化产品的过程，利用产物和杂质的理化性质，使用其他提取产物或从系统中去除杂质的工作。9.1概述，1 .发酵液的一般特性(1)发酵产物浓度低，属于稀水溶液体系。(2)成分复杂，含有目的产物、微生物细胞碎片、其他代谢副产品、残留培养基、无机盐等。(3)含有色素、热源物质、有毒物质等有机杂质。(4)发酵产物稳定性低，对热、酸、碱、有机溶剂、酶、机械力等敏感，在不合适的条件下容易失活或分解。2 .提取和精制，提取和精制是为了从发酵液中获取高纯度、符合质量标准怀化要求的发酵成品。发酵产物不同形态用途不同，产品质量要求不同，分离纯化程序也不同。大多数情况下，由发酵液预处理和菌体分离、提取、纯化、成品处理等四个阶段组成。发酵产品后处理流程图，如果是细胞内产物，首先进行细胞分裂，然后分离细胞碎片。一次精制主要是去除与目标产物性质有很大差异的物质，浓缩产物，提高产品质量。一般方法有沉淀、吸附、提取等。高度精炼后精制，在产品中使用具有高选择性的分离技术，去除与产品的物理、化学性质相似的杂质。典型的方法有色谱、离子交换等。成品加工为了得到质量验证的产品，使用了很多浓度、结晶、干燥等技术方法。9.2发酵液预处理及菌体分离，发酵液预处理及菌体分离是下游加工的第一步。目的改进发酵液的特性，去除部分可溶性杂质，分离蘑菇和其他悬浮颗粒，便于提取和纯化工艺。预处理中经常使用酸化、加热、添加絮凝剂、过滤、离心等方法。1 .发酵液的预处理、杂质直接影响产品的质量和产量，对提取和精制也有很大影响。特别是高价无机离子和其他蛋白质等。高价无机离子可能影响树脂的生化物质交换容量。杂蛋白降低树脂的交换容量及吸附能力，萃取溶剂时引起乳化，阻止过滤介质或污染过滤膜。(1)高价无机离子的去除：发酵液中的主要无机离子为Ca2、Mg2、Fe3等。钙离子经常使用草酸去除。为了消除Mg2对离子交换的影响，可以添加三聚磷酸钠形成Mg2和可溶性复合物。Fe3用黄血盐(钾铁氰尿酸)反应生成普鲁士蓝沉淀，去除。(2)去除杂蛋白：沉淀：用蛋白质等电点沉淀，在酸碱条件下添加负离子阳离子沉淀，或添加中性盐破坏蛋白质水合层沉淀。变质方法：加热变质、酸碱变质、有机溶剂变质等。吸附方法：吸附剂和沉淀剂吸附。(3)去除色素和其他物质的常用脱色方法是离子交换剂、离子交换纤维、活性炭等材料的吸附。2 .离心过滤从菌体分离，菌体分离一般使用离心和过滤两种方法。离心是离心力的作用，将悬浮液的固形物和液体分离出来，颗粒多用于小悬浮液和乳浊液的分离。离心法有微分离心、密度梯度离心、等密度离心、平衡等密度离心。细菌和酵母发酵液大部分使用离心分离。真菌和放线菌常用过滤分离。过滤的原理是当悬浮液通过过滤介质时，固体颗粒从溶液中分离出来。根据机理，过滤可以分为净化过滤器和过滤蛋糕过滤器。在净化过滤中，过滤介质由硅藻土、沙子、颗粒活性炭、烧结陶瓷、烧结金属等填充在过滤器内形成过滤层，当悬浮液通过过滤层时，固体颗粒被过滤层粒子阻挡或吸附，过滤液得到净化。过滤蛋糕过滤器，过滤介质是过滤布。悬浮液通过滤布时，固体颗粒被滤布堵塞，逐渐成为滤饼。滤饼具有一定厚度的过滤效果。(1)影响发酵液过滤的因素，发酵液为非牛顿液体，粘度大，过滤速度慢。过滤速度与细菌细胞体积、发酵条件、未使用的培养基浓度、泡沫剂、发酵周期等有关。(2)提高发酵液过滤性能的方法，如果发酵液难以过滤，则应改善过滤性能，降低滤饼电阻率，加快过滤和分离速度。提高发酵液性能的方法有酸调节、热处理、凝固剂、反应剂、过滤助剂等。 pH调整：去除蛋白质等阳性物质，改变容易吸附的分子的电荷特性，减少滤膜堵塞和污染。冷凝和絮凝：形成较大的絮体，减少堵塞。吸附剂方法：将细菌吸附在吸附剂上，产生大颗粒，减少堵塞。过滤助剂：硅藻土吸附细菌细胞等过滤助剂，改变过滤蛋糕结构，减少过滤阻力，提高过滤速度。3 .细胞被粉碎和分离，微生物的代谢产物是细胞内的物质(如一些酶制剂、干扰素、胰岛素等)，首先收集菌体进行细胞粉碎。(1)微生物细胞壁的组成和结构：细菌细胞壁：肽聚糖。酵母细胞壁比g细菌稍厚。主要成分是葡聚糖、甘露、蛋白质等。其他真菌细胞壁主要由甲壳素或纤维素的强度高于细菌或酵母的多糖组成。(2)常用的细胞粉碎方法、细胞粉碎方法有多种，可根据施加的作用力分为机械方法和非机械方法两类。电子有珠磨法、高压均匀化法、超声波法、X-press法；后者有酶解、化学法、物理法、干燥法等。机械法：高压均质法通过高压泵进行细胞悬浮，突然减压和高速冲击冲击冲击环使细胞破碎；X-press或Hughespress方法是将浓缩的细菌悬浮液冻结到-25 -30以形成冰晶，利用500Mpa以上的高压冲击从高压阀孔挤出冷冻细胞的改进高压方法。由于冰晶的磨损，嵌入冰晶的微生物变形，使细胞破碎。该方法范围广，破碎率高，细胞片段破碎程度低，活性保持率高。但是不能用于对冷冻敏感的生物材料。超声波法利用超声波的孔作用粉碎细胞，这种空化又因超声波的快速冲击而产生很强的冲击波压力，由此产生的粘性涡流在介质中对悬浮细胞产生剪切应力，使细胞内液体流动，引起细胞分裂。超声波振动容易引起温度的急剧上升，因此操作时可以将冰块放入细胞悬浮液中，或者通过中间层的人冷却剂冷却。非系统方法：酶解通过分解破坏细胞壁成分的特殊化学键，达到粉碎细胞的目的。添加剂和自溶解法(通常使用加热或干燥法)分开。渗透冲击法首先将细胞放入高渗介质中进行平衡，然后介质突然稀释，或者细胞被注入水或缓冲液中，水迅速进入细胞内，细胞膨胀，造成细胞壁破裂。重复冻融法导致低温突然冻结，室温熔化的重复细胞破碎。低温冷冻破坏细胞膜的疏水性结合结构，增加细胞的亲水性。同时，细胞内结晶改变细胞内/外溶液的浓度，导致细胞突然膨胀和破裂。该方法可用于处理比细胞壁脆弱的菌体，但通常破坏率低，重复情况也不能提高破坏率。还会引起对冻融敏感的蛋白质变性。干燥法可以使用空气干燥、真空干燥、喷雾干燥和冷冻干燥等。干燥过程会改变细胞膜通透性，在处理丙酮、丁醇、缓冲液等时，很容易提取细胞内物质。，(3)细胞片段的分离：一般离心方法。近年来，使用双水相萃取法，将生物大分子或细胞片段在两相或多相中不同分配，达到分离目的。在细胞碎片悬浮液中添加一种固体吸附剂，或通过装有吸附剂的固定床通过悬浮液，即可清除细胞碎片。9.3发酵产品的提取纯化，1 .沉淀法通过改变条件或添加某种试剂，使发酵产品脱离溶液，生成不溶性微粒并沉淀的过程。沉淀富集作用大于精制作用是初步分离的一种手段。沉淀法具有简单的设备、低成本、原料容易获得、高产量、高浓缩倍数和简单操作等优点，只是难以过滤，产品质量低，需要财政制度，这是缺点。(1)等电点沉淀法：利用两性电解质的电中性中溶解度最低的原理进行分离纯化。从低离子强度调整到等电点，可以使各种良性电解质的净电荷为零，从而大大降低溶解度。男女电解质各有不同的等电点，分开离开。很多蛋白质的等电点在部分酸性内，很多无机酸价格低廉，适合食品标准，可以在不去除残酸的情况下直接精制到下一步。缺点是酸化时容易发生蛋白质失活。许多蛋白质与金属结合时，等电点偏移。(2)盐酸盐法：在发火液中添加盐酸，使氨基酸成为氨基酸盐酸盐析出物，添加碱中和氨基酸等电点，使氨基酸析出。(3)金属盐法：在发酵液中添加重金属盐，析出不溶性氨基酸金属盐。沉淀物溶解后，将pH值调整到氨基酸等电点，沉淀氨基酸。谷氨酸萃取等电点锌盐法：产生谷氨酸和硫酸锌(ZnSO47H2O)、谷氨酸锌盐沉淀。钙盐法提取谷氨酸：等电点锌盐法，钙盐法提取谷氨酸的工艺，(4)有机溶剂沉淀法：许多有机溶剂(例如丙酮、乙醇、甲醇等)可以沉淀溶于水的小分子生物物质，以及核酸、多糖、蛋白质等生物大分子。这种沉淀主要是因为水溶液的介电常数减少，静电重力增加，带电溶质相互凝聚。有水合层的生物分子，由于有机溶剂和水的作用，水脱水，聚在一起沉淀。优点是降解能力高于盐析法，一种溶质仅在比较窄的有机溶剂范围内沉淀；降水不必脱盐。有机溶剂密度低，与沉淀物密度低，固液分离容易。有机溶剂容易蒸发，不会留在成品上，适合制造食品药物。蛋白质变性的失活容易，有机溶剂易燃易爆，对安全性要求高也是缺点。(5)盐析方法：在蛋白质溶液中添加一定量的中性盐，盐离子在水中水合，消除蛋白质脱水化膜层，暴露疏水区域，疏水区域相互作用，沉淀蛋白质；同时，中性盐的哈里会中和蛋白质所具有的电荷，削弱蛋白质分子之间的排斥作用，使它们相互凝聚。中性盐有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠等，生产上常用硫酸铵。其优点是成本低，操作简单，安全，对很多生物活性物质有稳定效果。(6)非离子聚聚合物沉淀：可用于选择性沉淀和纯化蛋白质，最常用的是聚乙二醇(PEG)。作用期有多种假说。聚合物类似有机溶剂，可以降低水合度，沉淀蛋白质。形成大分子和复合物，发生共沉淀作用等。优点：操作条件温和，不易引起生物大分子变性，沉淀效果好，沉淀后容易去除聚合物，广泛用于核酸、蛋白质、细菌、病毒等的分离和纯化。2 .膜分离技术，其本质是物质通过膜以不同的传递速度分离。优点：工艺一般简单，易于操作，成本低，效率高，不变，在室温下工作，特别适用于节能和热敏感材料的分离和精制。(1)膜分离技术分类，透析：膜两侧浓度差，从浓度高的一侧通过膜孔将溶质扩散到浓度低的一侧，进行分离的过程。电渗析：使用以电位差为动力的离子交换膜，选择性地通过负离子或正离子，从溶液中分离电解质的特性。微滤：利用微孔过滤，孔径为0.025m14m的多孔膜，过滤有颗粒的溶液，从溶液中去除颗粒，达到净化、分离和浓缩的目的。驱动力为压力差，通常为0.1MPa至0.5MPa。超滤：包含颗粒和大分子的溶液，过滤膜孔径为1nm20nm。使用压力差作为驱动力时，通常为0.1MPa到0.6MPa。反渗透：使用反渗透膜(光圈0.1nm1nm)，通过反渗透膜对溶液施加压力，使溶剂通过反渗透膜，切断所有可溶物分离的工作。以反渗透压力差为驱动力，工作压力为3MPa至10MPa。纳滤：以压力为动力，利用纳滤膜(孔径约2纳米)将相对分子质量3001000的物质与溶液分离的膜分离过程。其特点是在过滤分离过程中，在折衷小分子有机物的同时，可以对盐进行透析，进行浓缩和透析。工作压力低，节约动力。3 .提取方法为液体混合物添加溶剂，所需成分根据溶剂中的溶解度分离混合物的其他成分。液-液萃取也称为溶剂萃取，具有比化学沉淀法分离程度高的优点。与离子交换法相比，选择性好，物质传递快，能耗比蒸馏法低，生产力大，周期短，连续操作容易，自动控制等。(1)溶剂萃取：萃取目标物质在两种互不溶溶剂中溶解的不同溶解度，从一种溶剂转移到另一种溶剂中分离。提取步骤包括混合分离回收溶剂。提取工作过程分为单阶段提取和多阶段提取，多阶段提取分为多阶段错误流提取和多阶段逆流提取。单层萃取：仅使用一个搅拌机和一个分离器进行萃取。流程最简单，产出率不高。多阶段错误提取：每层添加新鲜提取溶剂，溶剂消耗量大，提取产物平均浓度稀，但提取更完整。多级逆流萃取：与萃取方向相反，仅在最后阶段加入萃取剂，萃取剂消耗少，萃取产品平均浓度高，产品收率最高。多阶段故障流提取(f液；s溶剂；l提取物；r拉菲酸酯；)，多级逆流提取，(2)超临界流体萃取：超临界流体作为萃取剂，从固体或液体中萃取特定沸点或热成分，以达到分离纯化的目的。超临界流体是物质在临界温度、临界压力上的一种流体状态，气体、液体二重性的特性，即密度接近液体，但粘度和扩散系数与气体类似。因此，除了仅次于液体溶剂的萃取能力外，还具有传质扩散速度快的优点。在超临界流体萃取中，主要是溶剂(超临界流体状态)密度的大幅增加，导致溶剂对溶质的作用力增加，形成溶解物质的能力。在临界点附近，压力或温度的变化会导致超临界流体密度的大变化，溶剂萃取能力主要取决于其密度，因此通过调节压力和温度，可以改变溶剂密度，从而改变该物质的溶解性。利用密度不同的溶剂的物质溶解能力差异实现萃取分离工作。过程由提取阶段和分离阶段组成。超临界萃取的典型过程，等温方法：在等温条件下，萃取相减压、膨胀、溶质从分离罐下部去除。气体由压缩机加压，然后返回萃取罐。等压法：等压条件下萃取相加热、加热、气体和溶质分离。溶质从分离组的下部取出，气体冷却，压缩，然后返回萃取罐。吸附法：溶质由分离组的吸附剂吸附，气体压缩后返回分离罐。等温方法(T1=T2，P1 p2)，等压法(t1 T2，P1=P2)，吸附方法(T1=T2，P1=P2)，(3)双水相萃取：利用互不溶性二相分配系数的差异分离纯化酶、核酸、生长素、病毒、干扰素等的萃取方法。