色谱分离技术ppt课件

第7章色谱分离技术，1、随着科学的进步，关系到人们生命安全的生物药品，特别是注射药品和生物工程产品等都需要高度精制。 但典型的分离方法(提取、结晶等)难以满足需求。 色谱法产生了。 发生的必然性，2，色谱分离是一系列相关技术的总称，又称色谱、色谱，是一种有效有用的生物分离技术。 在产品的最后精制工序(精制)中，色谱精制前需要用其他方法进行提取和初步精制。 近40年来，色谱技术已经成为生物高分子分离和纯化技术的极其重要的组成部分。 胰岛素、干扰素、疫苗、抗凝血因子、生长激素等。 3、概述、化学分析方法的基本要求是其选择性高。 即，在分析过程中，测量对象与潜在干扰物的分离是最重要的步骤！ 20世纪中叶，大量采用沉淀、蒸馏、提取等古典分离方法。 现代分析大量采用色谱和电泳的分离方法。 迄今为止，色谱法是最有效的分离手段！ 其应用涉及到所有的科学领域。 1903年，俄罗斯植物学家MikhailTswett首次发明。 他用填充了固体CaCO3微粒的玻璃柱，采用了植物色素的混合物(叶绿素和叶黄素chlorrophyllgraphein=write )。 20世纪50年代，色谱发展最快(对一些新型色谱技术的发展、复杂成分分析发展的要求)。 4、色谱的发展历程；5、色谱起着重要作用的诺贝尔奖研究；6、色谱分离的基本原理：利用外力将含有样本的流动相(气体、液体或超临界流体)固定在柱或平板上，使其通过与流动互不相容的固定相表面。 柱始端的样品各成分与两相起着一定程度的不同作用。 固定相和作用强的成分沿流动相流出的速度慢，固定相和作用弱的成分沿流动相流出的速度快。 根据流出速度的不同，混合成分最终形成各成分的“带”或“区域”，可以对依次流出的各成分物质分别进行定性定量分析。 7、8、色谱分类方法根据分离过程中相系的形式和特征，采用柱色谱填充柱色谱的毛细管色谱薄层色谱，9、流动相，采用气相色谱超临界色谱气相色谱法的流动相状态、液相色谱法的液相色谱法、柱色谱法的分类如表8-1所示。 10、11、色谱动力学过程，分离出色谱求出色谱，根据色谱(a )、色谱(b )、真色谱(c )、12、成分在固定相中的物理化学原理， 吸附色谱：不同成分在固定相中的吸附作用不同的分配色谱：不同成分在固定相中的溶解能力不同的离子交换色谱：固定相(离子交换剂)中的成分的亲和力不同的凝胶色谱： (不同尺寸的电阻色谱) :不同大小分子对固定相的渗透作用，13，色谱特征，1分离效率高的复杂混合物，有机同系物，异构体。 手性异构体。 2灵敏度高时，可检测10-1110-13g的物理量。 3分析速度通常能在几分钟或几十分钟内分析一个试料。 4应用范围广的气相色谱：沸点低于400的各种有机或无机试样的分析。 液相色谱法：高沸点，热不稳定，生物样品分离分析。 不足之处：分离出的成分很难定性。、14、吸附色谱分配色谱分离开关凝胶色谱高效液相色谱亲和性色谱、15、一、概况、1 .发展史、创始人： Tsweet)1906、石油醚、连续墨带色层或纸色谱、薄层色谱、气相色谱、高效液相色谱、2 .色谱的特点，(1)概念色谱是物理分离方法，利用不同物质在两相中具有不同的分配系数，通过两相不断的相对运动实现分离的方法其中一相为固定相，通常表面积大或多孔性固体的另外一相为流动相，为液体或气体. 17、流动相流过固定相时，由于物质在两相间的分配情况不同，经过多个差分分配到达分离或者容易分配到固定相的物质的移动速度慢，容易分配到流动相的物质的移动速度快，因此逐渐分离。18、(2)基本特点：分离效率高。 其效率是所有分离纯化技术中最高的，这种高效分离尤其适用于极其复杂的混合物。 应用范围广。 (非)极性、(非)离子型、小分子和大分子、无机和有机和生物活性物质、热(不稳定)稳定化合物； 特别是生物高分子的分离不能取代其他方法。 选择性强。 变参数多：不同的色谱分离方法，固定相和流动相，操作条件。 设备简单，操作方便，不含强操作条件，不易改性物质，特别适用于不稳定的高分子有机化合物。 19、缺点：处理量小，操作周期长，不能连续操作，主要用于实验室，在工业生产中应用较少。 20，3 .色谱分类、分离机理操作方法流动相的物理实验技术、吸附色谱分配色谱法离子开关色谱法凝胶色谱亲和色谱法、柱色谱法薄层采用、气相色谱法的液相色谱、正面法取代法的溶出分析法、采用21，4 .色谱法的分离方法的选择、一次代谢产物：氨基酸、有机酸、核苷酸、单糖类、脂肪酸二次代谢产物：生物碱、萜烯类、苷类、色素、单宁类， 抗生素生物高分子：蛋白质、酶、多肽、核酸、多糖、目的产物、22、色谱分离方法的选择依据：目的产物的分子结构、物理化学性质及相对分子质量； 主要杂质，特别是分子结构、大小和理化特性接近目标物的杂质成分和含量目标物在色谱分离过程中生理活性的稳定性。 23、2、吸附色谱、溶质与吸附剂之间根据分子吸附力的不同进行分离的方法。 吸附剂是一些多孔物质，表面充满了许多吸附部位，即活性中心。 吸附色谱过程是样品中各成分的分子和流动相分子争夺吸附剂活性中心取得平衡的过程。 被吸附的物质叫做吸附物。 吸附力主要是范德瓦尔斯力，有时形成氢键或化学键。 24、(1)基本原理溶液中某些成分的分子在运动中碰到固体表面时，分子粘在固体表面上，产生吸附作用。 1 .产生吸附作用的原理：固体表面分子(或原子)和固体内部分子(或原子)所处的状态不同：固体内部分子(或原子)受到接近周围分子的力是对称的，力的总和为零，即相互抵消，因此分子处于平衡状态。 界面的分子受到的力是非对称的，力的总和不是零，力指向固体内部。25、2 .吸附类型：物理吸附化学吸附交换吸附，26， 物理吸附化学吸附、发生方式、分子力(范德华力)、库仑力(电子转移、化学键的生成)、活化能、低、高、温度、低温、高温、发热量、小、大、速度、易达到平衡、慢、平衡慢、选择性、不严格、强、 27交换吸附：吸附剂的表面由极性分子或离子构成时，吸引溶液中带有相反电荷的离子形成双电层的同时，释放出相同物质量的离子，引起离子交换。 离子的电荷是决定因素，离子带电的电荷越多，吸附剂表面的相反电荷点的吸附力越强。 水合半径越小，电荷相同的离子越容易吸附。 28，3 .常用吸附剂：有机吸附剂：无机吸附剂：活性炭、纤维素、多孔质吸附树脂、聚酰胺、氧化铝、硅胶、沸石、磷酸钙、氢氧化铝、化学结构分类、29，4 .吸附色谱的基本过程和分类、(1)过程、30、(2)分类， 吸附薄层色谱柱色谱、操作方法不同，31 5 .吸附薄层色谱(thinlayerchromatography，TLC )薄层色谱：将吸附剂和支持剂均匀地铺在玻璃板上，制成薄层，将分离的样品适当地分离至薄层的开始线、32、(1)原理：利用混合物中各成分的物理化学性质差异，在色谱过程中，通过不相溶的两相分布不同，达到分离的目的。 吸附剂：涂布在薄层板上(固定相)展开剂：展开过程中流过固定相的溶剂(流动相)、二相、33，将分离的样品溶液点在薄层板的一端，用适当的溶剂(展开剂)在密闭的容器中展开。 34、溶剂流动后，不同物质在吸附剂和展开剂之间会发生连续吸附、解吸、再吸附、再解吸。 由于吸附剂对不同物质的吸附力大小不同，因此对极性大的物质的吸附力强，对极性小的物质的吸附力弱。 35、移动速度的差异：易吸附物质相对移动慢，在片材上移动的距离小，难吸附物质移动快，移动距离大。 36、随着时间的推移，不同的物质相互分离，最后形成相互分离的斑点。 将展开的薄片从密闭容器中取出后，用特定的方法使斑点显色，达到定性和定量的目的。 37、(2)吸附剂和展开剂的选择：吸附剂：氧化铝、硅胶和聚酰胺展开剂：由实验决定。 极性越大，对物质的洗脱能力越强，38、(3)基本操作，薄层色谱板的制备，点图案，展开，显色，、薄层板的制备：在一块玻璃板(薄的厚度一致，表面光滑)的表面涂布薄的吸附剂，例如硅胶或氧化铝等。 (-涂布)为了提高薄层的牢固性，容易保存，可以在涂布中加入粘接剂。 羧甲基纤维素钠(CMC-Na )，40，点：用毛细管吸取样品溶液，轻轻接触薄层，自动吸取样品至薄层。1.5-2cm、直径3mm、41、展开：在密闭容器中进行：色谱气缸。 最常用的展开法：将上游展开法的薄板放入色谱槽时，不要将溶剂浸渍在样品点。 当溶剂移动到接近片材的上端缘时，取出片材，切断溶剂的前端。42、显色：又称定位，用某种方法使用色谱展开的混合物各成分的斑点显色。 每种化合物都有特定的显色剂。 各种物质常用的显色剂和万能薄层显色剂，43，显色方法：喷雾显色法紫外线照射法碘蒸气显色法生物显色法，部分化合物在紫外线下产生荧光或暗色斑点，充满碘蒸气的容器中，多数天然药物成分产生褐色斑点，抗生素等生物活性物质， 各种化合物具有特定的显色剂，44，6 .吸附柱色谱，(1)基本原理与薄层色谱相同。吸附剂：氧化铝、硅胶、聚酰胺、活性炭(2)柱：玻璃柱、45、柱色谱装置、46、(3)基本操作、柱、上模、溶出、吸附剂、干式柱湿式柱、被分离物质、干式法上模、梯度溶出、各组相继溶出、47、3、分配48、分配色谱：利用分离物质中各组分在两种相溶液之间的分布情况差异来分离混合物。 相当于一种连续的溶剂萃取方法，固定一种溶剂，用另一种溶剂冲洗的分离不经过吸附工序，只需溶剂的萃取即可。 (1)基本原理，49，固定相：作为柱内固定的液体流动相：冲洗液使用，载体：固定相滞留在柱内的固体，在溶出过程中流动相与固定相接触，样品中各成分的两相间的分布不同，因此向下方移动的速度不同，容易溶解于流动相的成分的移动快，固定相中溶解度大的成分的移动(溶解度)将含有固定相的载体放入色谱柱中，加入被分离溶液，洗脱、分离：50，(二)载体，固定相和流动相的选择，1 .载体的选择无活性，没有吸附能力，可吸附较多的固定相。 主要有硅胶、硅藻土、纤维素、聚乙烯粉2 .固定相的选择水、缓冲液、酸的水溶液“反相色谱”:有机溶剂为固定相的3 .展开剂的选择，51，(3)基本操作，色谱柱、上模、溶出，52，4，离子交换色谱法，与离子交换法的区别是什么？ 离子交换法：应用离子交换剂作为吸附剂，通过静电引力使溶液中带有相反电荷的物质吸附在离子交换剂上，用适当的洗脱剂使吸附物从离子交换剂中洗脱，达到分离、浓缩、纯化的目的。 由离子交换树脂构成的活性离子交换色谱的固定相应是什么？53、离子交换色谱：以离子交换树脂为固定相，以适当的溶剂为流动相，以不同的离子交换亲和力分离溶质的方法。 利用离子交换原理与液相色谱技术的结合测定溶液中阳离子和阴离子的分离方法. 54、基本原理：带电物质在电荷力的作用下分配在固定相和流动相之间，相互分离。 两性电解质(蛋白质、氨基酸)在溶液中的净电荷种类和数量不同： pH=pI； pHpI？ 溶液的pH越远离pI，净电荷量越大。 55、由于各种蛋白质等生物高分子的等电点不同，改变溶液的pH和离子强度可影响和分离离子交换树脂的吸附作用。 离子交换树脂(固定相)的性质、种类、选择依据、离子交换色谱的操作和应用，56，5，凝胶色谱，凝胶色谱：以凝胶为固定相，根据分子大小分离的方法。 其过程类似于过滤，也称凝胶过滤、分子筛过滤等。 凝胶：具有无电荷三维空间的多孔网状结构物质，凝胶的各个粒子的微细结构像筛子一样。 57、将具有一定孔径的多孔质亲水性凝胶作为载体利用，分子尺寸不同的混合物通过该凝胶柱时，直径比凝胶孔径大的分子无法进入凝胶的内部，因此，伴随溶剂在凝胶的间隙中向下移动，最初流出柱外的直径比凝胶孔径小的分子会发生凝胶凝胶这样不同大小的分子被路径分离，大分子物质先被洗脱，小分子物质后被洗脱。(1)原理、58、小分子、59、(2)凝胶过滤介质、基本要求：原料成分和排除以外的相互作用，例如电荷作用、化学作用、生物学作用高的物理强度、高化学稳定性高温高压、强酸碱高的化学惰性的内孔径分布范围窄的粒子的大小一次性高，为60、常用的凝胶过滤介质、葡聚糖凝胶琼脂糖凝胶右旋糖酐Dextran交联而成的。 制备凝胶时按不同比例添加交联剂，可以得到交联度不同的凝胶。 交联剂在原料总质量中所占的比例称为交联度。 交联度大：网状结构致密，吸水量小，交联度小：网状结构疏松，吸水量大，化学性质稳定，不溶于水、弱酸、碱和盐溶液，62，2 .琼脂糖凝胶来源于海藻多糖琼脂，为天然凝胶，以氢键而非共价键交联，结合能弱。 气孔率通过改变琼脂糖凝胶浓度(与葡聚糖不同)(与琼脂糖凝胶电泳相关)化学稳定性：琼脂糖凝胶葡聚糖凝胶没有干凝胶，必须在膨润状态下保存。 可以分离出63，数万到数千万