基因表达载体的构建ppt课件

第6章外源基因在大肠杆菌中的表达调控，第1节基因表达概要和基本条件第2节在大肠杆菌中影响外源基因表达的因素，第1节基因表达概要和基本条件，第1、基因表达基本概念第2、基因表达基本条件第3、真核基因在原核细胞中的表达和调控， 第2节是大肠杆菌中影响外源基因表达的因素之一，启动子结构对表达效率的影响二，表达载体的选择三，密码子在外源基因(cDNA )中的作用四，mRNA的初级结构和基因表达五，mRNA的次级结构对翻译起始的影响六，mRNA稳定性的影响七， 转录终止区外来基因表达效率的影响8、转录后的几个要素与基因表达的关系9、宿主选择对表达的影响10、培养条件的调控对表达效率的影响，1、基因表达的基本概念，生物体的基因信息全部以核苷酸序列编码的形式积蓄在基因物质DNA中，基因表达是目的基因的表达取决于有效转录和mRNA正确翻译及翻译后加工处理等各个环节的调节作用，其中转录最为重要，原核的基因表达过程和方式与真核细胞显着不同。二、基因表达的基本条件，1 .外源基因插入序列必须保持正确的方向和阅读框架。 那个遗传代码不可以是遗失、遗失或者错位或者错误。 错误的蛋白质分子，特别是目标基因序列内部不含两端酶切位点的识别序列。 2 .插入的外源基因必须在原核启动子控制下，即原核的RNA聚合酶能够识别插入的基因。 3 .外源基因能有效转录到大肠杆菌(如无内含子)，转录的mRNA在菌体内相当稳定，且能有效翻译，翻译的蛋白质分子在菌体内不受菌体蛋白酶的分解。三、真核基因在原核细胞中的表达与调控、真核基因在原核细胞中的表达与调控特征、有效转录及其调控因素、有效转录及其调控因素、1.RNA聚合酶2 .启动子及其转录作用(启动子的概念、分类)3.转录作用结束4 .转录的弱化作用、 正确转录1 .起始密码子(intiqtioncodon，initiator)2.核糖体结合位点(也称为RBS，SD序列)、原核表达载体的构建、原核表达载体的构建的要求1 .表达载体类型2 .表达载体的例子3 .包涵体表达载体、 启动子；(lac )；Trp启动子；(tac启动子；)噬菌体的PL和PR启动子；(LPP )；启动子结构对表达效率的影响效果比17bp差，不同产物选择不同启动子如尿激酶用ptac、IL2/2FU-V用PRPL启动子效果更好。表达载体的选择，载体的分子量不能过大，2.5-5.6kb为好，高拷贝，不同产物选择不同类型的表达载体。 外源基因(cDNA )密码子的作用，细菌的基因表达对密码子具有嗜好性，不嗜好稀有密码子(AGA，AGG )的表达效果差，特别是AGA-AGG连续序列存在时表达效率低，mRNA的一级结构和基因表达，起始密码子：表达效率例如，SD序列的uaagg高于agaa的3倍和AUG间距通常是6-12bp和4-10bp。具有5- ugu au的SD序列的5非翻译区域具有优化的9bp。mRNA的二级结构对翻译开始的影响，mRNA形成二级结构后形成茎环。 如果SD序列、AUG位于茎环内或发夹内，则在抑制翻译的茎环外，翻译非常方便。 从表6-1，mRNA稳定性的影响来看，REP序列能阻止mRNA的分解，密码子也发挥保护作用。真核基因在原核细胞中的表达和调控特点是，唯一的RNA聚合酶以操作子为单位完成基因转录基因转录的RNA切断功能是无核、无核膜、核酸外露，因此转录和翻译是连续进行的转录产物在聚糖体上合成的，同时多肽链特有的SD 控制mRNA与核糖体有效结合和翻译的无糖基化功能是RNA聚合酶，原核细胞是唯一的RNA聚合酶，其核酶与因子结合形成全酶后，可以识别并转录DNA上的启动子。 启动子的概念是启动子位于结构基因上游，转录开始控制所需的DNA序列，包括-35区(与因子结合)和-10区(与核酶结合)的维护序列。 启动子与全酶结合后，如图6-1所示，可以从一个转印开始点开始转印。转录作用的结束通过转录终止子发挥作用，能够终止转录的关联DNA序列称为终止子。 强终止子：不依赖因子发挥终止作用，回文序列中G/C对多，有4个以上的u，因此RNA聚合酶的构象改变而中止了转录。 如图6-9所示，依赖于图6-10的弱终止符：因子发挥终止作用。 图6-11，转录的弱化作用，转录的弱化作用在转录没有到达终止信号的中途停止，mRNA转录的发生部分停止。起始密码子、起始密码子编码多肽链的第一位氨基酸的密码子AUG (或ATG )、蛋氨酸(蛋氨酸)。 细菌中也有罕见的起始密码子GUG，编码着缬氨酸。 其最初的表达作用是AUGGUG。核糖体结合位点、转录mrna AUG上游与核糖体的有效结合和翻译所需的序列(RBS )、长度为3-9bp、AUG3-11bp，它与16 srrna 3末端(auuccuccuccuccac-dag-5 )互补，SD与aug的间隔等图、表达载体的类型、表达载体的类型主要有4种： PKK223-3是图6-14的分泌型表达载体，例如PIN-ompA1是图6-15的融合蛋白质型表达载体，PGEX是图6-16的封入型表达载体，例如pBV220是图6-16 构建原核表达载体的要求，完整的表达载体(质粒)需要强启动子(p )、终止子(t )、多个酶切位点、抗性标记、复制因子和RBS的SD序列。 (图6-13 )质粒的复制能力和稳定性、转铁蛋白的表达形式和保存位置(分泌型/封入体/融合蛋白)、蛋白质的分子量、性质和稳定性、适当的宿主细胞选择等也应予以考虑。没有乳糖启动子(Lac )，没有乳糖时，调节基因(I )产生抑制蛋白质和操作基因的结合，阻止RNA聚合酶的结合，有阻止转录的乳糖时，乳糖与抑制蛋白质结合，解离其结构，发挥转录功能。 如图62所示，LacZ基因可以通过IPTG (异丙基硫代- d半乳糖)诱导转录。 Lac启动子的改良是在图6-3、6-4(a)(b )、Trp启动子、色氨酸启动子(Trp )的抑制蛋白质有色氨酸时，两者结合，抑制蛋白质结构激活并与启动子结合，阻止RNA聚合酶的转录当色氨酸不存在时，抑制被解除，-吲哚酸是色氨酸的竞争抑制剂，因此常用作诱导剂，诱发色氨酸的启动子转录。 (图6-5 )同时声子对Trp转录也有调节作用(图6-6 )、Tac启动子、Tac启动子是由Trp启动子和Lac启动子构建的异质耦合启动子、-35区是Trp启动子顺序、-10是LacUV5启动子顺序该启动子用IPTG诱导转录即可。 图6-7，噬菌体的PL