细菌学检验基本技术

1,第二章细菌学检验基本技术,邵丽军,2,主要内容,第一节样本的采集与送检原则第二节细菌的分离培养方法第三节细菌的形态结构检查法第四节细菌的生化反应检查法第五节细菌的血清学检验第六节细菌毒素的检测第七节细菌数量的测定第八节细菌L型检验第九节微生物菌种的保藏及保管,3,第一节样本的采集与送检原则,一、细菌学检验样本的类型正常人体样本，如排泄物、血液、血清等食品、水产品、化妆品、药品、消毒及卫生用品、医疗用品及环境（水、土壤、空气，各种物品）等卫生样本，包括常规卫生评价、公共卫生事件、环境监测、委托送检等标本临床各种感染材料（试剂、样品、耗材、医疗废弃物等）动物尸检或感染材料。,4,二、采样的一般原则（1）无菌原则采样用具要无菌且在有效期内；采样操作程序要无菌；如果采样部位需要经过皮肤和粘膜时，做好外表面的消毒，防止污染。密封送检（2）选择正确的采样时间分离病原菌时，应早期采样；最好是病人发病早期、急性期或症状典型时；用药前采样，或停药24h采样，或下一次用药前采样用于血清学诊断时，急性期及恢复期采集双份血清。,5,（3）选择正确的采样部位根据感染特点、病程发展及目的菌可能存在的部位，选择合适的解剖部位采样。（4）采集足够量样本采样量不能太少，过少样品会导致假阴性结果；卫生样本要具有代表性，否则会影响评价的准确性。（5）多样性采集感染进程复杂的，应多部位或多时间段采样，以防漏检。（6）做好采样记录记录样本类别、采样时间、地点、采样量及采样人等信息。,6,三、样本送运原则（1）选择适当的温度和时间送检时间长或温度高，菌相将发生改变，影响结果的准确性；应遵循尽快送检的原则；常规细菌学检查，不超过2h，最好1h内，保存在4中不超过24h。含有脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、流感嗜血杆菌等的样品，低温自溶，应在25常温送检或用便携式培养箱送检,7,（2）选择正确的气体环境针对厌氧菌样本，注意隔绝空气氧；如使用专门的厌氧采样瓶或试管，或人为的排出空气，或直接接种于厌氧培养基或放在厌氧袋、厌氧盒中（3）保持密闭状态,8,便携式恒温培养箱,便携式冷藏保温箱,厌氧培养袋,厌氧罐,厌氧瓶,9,第二节细菌的分离培养方法,细菌的分离培养提供细菌生长所需的各种条件（营养、温度、湿度、酸碱度和气体），从样本中获得该种细菌活的纯化物的过程。主要内容包括培养基制备、细菌接种方法、细菌培养方法、细菌的生长现象,10,11,一、培养基的制备,培养基是指经人工配制，将供细菌生长繁殖需要的各种营养物质按比例配制而成的基质，可用于细菌的分离纯化、传代、鉴定、菌种保存等。,12,（一）培养基的主要成分及其作用P261.营养物质：碳源、氮源及其它营养物质（蛋白胨、肉浸液、牛肉浸膏、糖类、血液、鸡蛋、动物血清、酵母粉、生长因子、无机盐类）。2.水分：常用蒸馏水。3.凝固物质：琼脂、明胶4.抑制剂和指示剂：如胆盐、抗生素、酸碱指示剂、氧化还原指示剂等。,13,（二）培养基制备的一般程序,调配,矫正pH,过滤澄清,分装,灭菌,检定,保存,称量、溶解,氢氧化钠、盐酸（0.1mol/L、1mol/L）高出所需pH0.1-0.2个单位,先调pH，沸水加热5-10min，冷却后过滤；滤纸、绒布等过滤,液体：不超过容器2/3；斜面：1/管；半固体培养基：1/3管；高层斜面：1/41/3管；平板：1315ml,耐高压：121，15min含糖：115，15min鸡蛋、牛奶等：间歇灭菌3天3次不耐高温的血清、尿素等：滤过除菌,外观：完整性、水分浸入、色泽异常、培养基外溢、干裂等弃去。无菌试验：放入361过夜，有菌生长弃去。功能检查：标准菌株培养2448h，无菌或生长不好。重复接种结果仍同前，弃去。,冷藏，不宜过久。防止干涸、变质和污染。,14,所用器材及过程,培养基、玻璃器皿天平、药匙,15,以量筒装取适当量蒸馏水于玻璃容器中于玻璃容器上标示培养基名称,16,放上秤药纸並归零以秤药匙舀出适当量药品(请看培养基配方上说明),17,倾倒培养基时小心不要沾到玻璃壁上,18,清理配药桌面与天平清洗秤药匙，擦干放回药品放回药品柜,19,1.按物理性状分类液体培养基半固体培养基（琼脂含量0.51%）固体培养基（琼脂含量22.5%）,（三）培养基的种类,20,液体培养基,主要用于增菌培养、生化试验等,21,制备平板、斜面、高层及高层斜面，用于细菌分离培养、鉴定和保存、増菌等。,固体培养基,22,观察微生物的动力，分类鉴定、保存菌种以及噬菌体效价滴定等。,半固体培养基,23,2.按成分分类合成培养基由化学物质和成分已知的各种物质所组成，可以是无机盐类，或无机盐类加有机物质。各批次性质稳定，用于细菌代谢、分类、菌种选育、遗传分析等情况使用。天然培养基化学成分不完全清楚，各批物质的成分很难一致，如蛋白胨、牛肉膏、血液、鸡蛋。成本较低，在细菌学研究中常用。,24,3.按用途分类（1）基础培养基含有大部分细菌生长繁殖所需的最基本的营养成分。普通肉汤、营养琼脂、蛋白胨水等（2）营养培养基在基础培养基上加入葡萄糖、血液、血清等营养成分，以满足对营养要求较高和需要特殊生长因子的细菌生长繁殖。血液琼脂培养基、血清肉汤培养基、巧克力血琼脂培养基。（3）增菌培养基在普通培养基中加入一些某种微生物特别喜欢的营养物质，以增加这种微生物的繁殖速度，逐渐淘汰其它微生物。多为液体培养基，一般具有选择性抑制作用的抑制剂。有助于目的菌的增殖,25,常用増菌培养基,26,（4）选择性培养基多为固体培养基，加有抑制物质，抑制其它非目的菌的生长或使其生长不佳。,27,常用的选择培养基,28,（5）鉴别培养基利用各种细菌分解糖类和蛋白质等的能力及其代谢产物的不同，在此类培养基中加入了某些特定的作用底物，用于检查各种细菌的生化反应，以鉴别和鉴定细菌。,29,（6）厌氧培养基培养基氧化还原电势低，有利于厌氧菌的生长。如庖肉培养基肉渣中含有谷胱甘肽