第六章 农药残留量的检验

第六章农药残留量的检验,农药残留检测技术,目的要求通过本章的学习，目的是使学生掌握农药残留的定义、分类、来源；农药残留毒性；农药残留分析的目的；农药残留的各种分析方法等相关知识。学习要点一般掌握：农药残留的来源；农药残留的定义、分类；农药残留的毒性等重点掌握：农药残留前处理及分析检测方法。,一、农药和农药残留1、农药广义：农业上使用的化学品狭义：主要是指用于预防、消灭或控制危害农、林、牧、渔业生产的有害生物（害虫、害螨、线虫、病原菌、杂草及鼠害等）和有目的地调节植物、昆虫生长的化学药品及生物药品。,第一节概论,2、农药残留指农药使用后残存在生物体、食品（农副产品）和环境中的微量农药原体、有毒代谢物、降解物和杂质的总称。,3、农药残留限量世界卫生组织和联合国粮农组织（WHO/FAO）定义为：按照良好的农业生产规范，直接或间接使用农药后，在食品和饲料中形成的农药残留物的最大浓度。（表示为mg/kg或g/kg）在世界贸易一体化的今天，农药最高残留限量也成为各贸易国之间重要的技术壁垒。,最大残留限量是按各地居民膳食习惯，每日食用食品的种类和数量计算的，其量不超过该农药的日许量。计算公式：MRL=ADI平均体重(kg)(人的每日食物总量(kg)食物系数(%)每日允许摄入量(acceptabledailyintake,ADI)是指人或动物每日摄入某种化学物质（食品添加剂、农药等），对健康无任何已知不良效应的剂量。以相当人或动物公斤体重的毫克数表示,单位一般是mg/Kg,或个g/Kg。例如某化学物质对人体的ADI值为5mg/Kg，按体重50Kg计算，则每日摄入该化学物质在250mg以内是安全的。ADI值越高，说明该化学物质的毒性越低。,：为不得检出,：为不得检出,二、农药的分类1、按农药的来源分类：可分为矿物源农药、生物源农药与有机合成农药矿物源农药：有的是无机矿物原料经加工，有的是用矿物油加工成乳剂。ex：砷制剂、氟制剂、铜制剂与硫制剂生物源农药：主要有植物源农药和微生物源农药。除虫菊素、阿维菌素、苏云金杆菌有机合成农药：占农药品种的绝大部分，它们是通过化学工业，用有机合成工艺生产出来的。,2、按防治对象分类杀虫剂、杀螨剂、杀菌剂、杀线虫剂、除草剂、杀鼠剂、杀软体动物剂、植物生长调节剂等。,3、按化学成分分类可分为有机氯、有机磷、氨基甲酸酯类、拟除虫菊酯类等。常见有机氯类农药：666、DDT、狄氏剂、艾氏剂、毒杀芬、氯丹、七氯、五氯酚钠等具有高度的物理、化学、生物学稳定性，在自然界不易分解，高残留。脂溶性强。,常见有机磷农药：对硫磷（1605.）、内吸磷（1509）、甲拌磷（3911）、马拉硫磷（4049）、乐果、敌百虫、敌敌畏（DDVP）、杀螟松属于磷酸酯或硫代磷酸酯类化合物。大多为无色或黄色的油状液体，部分为低熔点的固体如敌百虫、乐果等。可溶于有机溶剂，性质不稳定，易光解、碱解和水解。,氨基甲酸酯类：分为五大类：萘基氨基甲酸酯类，如西维因；苯基氨基甲酸酯类，如叶蝉散；氨基甲酸肟酯类，如涕灭威；杂环甲基氨基甲酸酯类，如呋喃丹；杂环二甲基氨基甲酸酯类，如异索威。除少数品种如呋喃丹等毒性较高外，大多数属中、低毒性。拟除虫菊酯类：一类仿生合成的杀虫剂，是改变天然除虫菊酯的化学结构衍生的合成酯类。多达19种，氰戊菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯等。拟除虫菊酯是一类能防治多种害虫的广谱杀虫剂，其杀虫毒力比老一代杀虫剂如有机氯、有机磷、氨基甲酸酯类提高10100倍。,4、按作用方式分类1、杀虫剂胃毒剂触杀剂熏蒸剂内吸剂2、杀菌剂保护作用治疗剂铲除剂3、除草剂触杀性除草剂内吸性除草剂,三、农药残留的来源,直接污染间接污染由食物链和生物富集作用造成污染意外事故造成的食品污染,2008年2月9日，第二届名古屋中国春节祭在当地的久屋大通公园隆重开幕，专程从东京赶来的的中国驻日大使崔天凯在春节祭上品尝了展台上“老三饺子”。,四、农药残留的危害,农药残留对健康的影响对神经的影响；致癌作用；对肝脏的影响；诱发突变；慢性中毒。药害影响农业生产农药残留影响进出口贸易农药残留污染环境、破坏生态,五、农药残留样品的采集,1、样品的种类主观样品为研究农药残留量与各种因素的关系，从设计的实验区域内采集的样品。客观样品监测样品和执法样品，测定的农药残留种类是未知的或施药背景不清楚的样品。,1、实验室样品从群体采集的送到残留分析实验室的样品。2、检测样品实验室经过缩分减量或经过精制后的样品。3、检测样份从检测样品中称取的用于分析的样品。4、检测溶液经过提取、净化后进入待测状态。,知识窗,2、取样方法监测调查取样：随机、概率、分布水平执法取样：强制性、超标与否3、商品取样量要求小的或轻的产品1.01.5Kg中等大小产品2.02.5Kg大的产品4.05.0Kg肉、禽、鱼1.01.5Kg谷物和制品0.51.0Kg,4、不同样品的采集要求根茎类蔬菜采集整个果实叶类蔬菜除去腐烂和枯萎部分豆类整个果实果类蔬菜去除茎部谷物整个籽粒肉类整体,5、样品的包装、记录和贮存,标签（2个）,编号：样品名称：采样时间：地点：,要求：温度湿度光照单独存放,6、样品的预处理,粉状物谷物小体积水果和蔬菜大体积水果和蔬菜液体样品土壤,对含水量较高的样品预处理方法肉：放入铰肉机中铰匀水果蔬菜等，放入高速组织捣碎器搅匀蛋类食品，去壳后用打蛋器打匀。对于包装食品，取出各种调味品后，再制备均匀。,第二节样品前处理技术,样品前处理：采样技术和样品制备技术。,样品处理的原则：制备过程中避免组分发生化学变化；要防止和避免欲测定组分的沾污；尽可能减少无关化合物引入制备过程；尽可能简单易行。,样品制备原理,利用残留农药与样品基质的物理化学差异，使其从检测系统有干扰作用的样品基质中提取分离出来（相似相溶）。极性-溶解度、分配系数；挥发性-蒸汽压。,分子的极性和水溶性,1、极性提取、净化条件的依据。相似相溶原理：使用与农药极性相近的溶剂为提取剂，使残留农药在溶剂中达到最大溶解度。极性判断：电负性、双键、对称性表示：氧化铝吸附剂上洗脱供试溶质的能力,2、水溶性农药的极性决定其在溶剂中的溶解性。影响溶解性的其他因素温度：高溶解性高含盐量：盐会降低有机物的溶解度。pH：影响可解离的农药的溶解度,分配定律：在一对互不相溶的两相溶剂系统中，由于物质在非极性相和极性相中的溶解度不同，当达到平衡时，物质在该两相中的浓度比在一定条件下为常数的定律。KD（分配系数）=A非极性相/B极性相,挥发性：液态或固态物质转变为气态的物理性能。挥发性决定：物质在气-液或气-固两相中的分布。分为沸点和蒸汽压。蒸汽压：固态、液态气态,样品制备（提取）,提取:是指通过溶解、吸附（吸着）或挥发等方式将样品中的残留农药分离出来的操作步骤，也叫萃取。避免：强酸、强碱、高温、剧烈操作极性-溶解度、分配系数；挥发性-蒸汽压。,常用样品制备技术,溶剂萃取,蒸馏技术,固相萃取,微波萃取,衍生化,超临界萃取,样品制备,一、溶剂萃取技术,溶剂萃取：溶解性差异，选用对残留农药溶解度大的溶剂，将分析物从样品基质中提取出来的方法。关键：选择合适的提取溶剂。,1、分类,液-液萃取,液-固萃取,液-气萃取（溶液吸收）,萃取对象,2、液-液萃取,两种不相容的液体,水溶剂：亲水化合物进入到水相中。,有机溶剂：疏水性化合物将进入有机相中的程度就越大。,液-液萃取原理,利用样品中不同组分分配在两种不混溶的溶剂中溶解度或分配比的不同来达到分离、提取或纯化的目的。,有机相,水相,Nernst分配定律（1）,KD=cocaq,有机物质在有机溶剂中的溶解度一般比在水相中的溶解度大，分配系数越大，水相中的有机物可被萃取。,Nernst分配定律（2）,式中：m0是被萃取溶液中溶质（X）的总含量，mn是经过n次萃取后，X在溶剂中的剩余量，V是被萃取溶液的体积，VB是每次萃取所用溶剂B的体积（均为VB），n是等量萃取的次数。,液-液萃取步骤（1）,溶剂体积为样品溶液的3035。,振荡几次,打开活塞,Gas,蒸气逸出（也叫放气）,液-液萃取步骤（2）,絮状物（乳化）,有机相,水相,水相和絮状物,静置分层,激烈振摇12min,液-液萃取步骤（3）,产生乳化的原因,由于液-液萃取过程中剧烈振动，经常发生乳化现象，特别是那些含脂肪的样品。原因：体系的性质、离子浓度、有机相粘度、萃取温度、pH等。温度越低，有机相粘度越大，离子浓度越高越易产生乳化。,破乳的常用方法,通过改变KD;改变溶剂或化学平衡作用的添加剂;缓冲剂调节pH;盐调节离子强度等。,离心法破乳，2000r/min，2min；无水硫酸钠研磨法破乳；蒸干法，蒸干后，再用有机溶剂萃取。不适用挥发性物质的萃取。,A、高度乳化（即全部乳化）,B、中度乳化（乳化率达50）,电解质破乳。加入无机盐，通过提高体系中水相的比重使两相分层；破乳率与加入电解质的量成正比。lmol/L的盐酸；无水乙醇溶解两相液滴；无水硫酸钠漏斗过滤。,C、轻度乳化（两相间形成一薄乳化层）,玻璃棒搅动，削弱吸附作用；静置一定的时间后，可自然分层。因为乳浊液是液体杂质以微小珠滴散布在液体溶剂中的一种分散体系，是热力学不稳定体系。,3、液-固萃取,固体萃取溶剂振荡（加热）离心/过滤分离欲萃取组分进入溶剂。,萃取过程,溶解和扩散的过程,分子扩散：固体样品表面/溶剂接解处影响因素：温度、分子大小和液体介质的黏度。对流扩散：远离固体样品表面处的扩散影响因素：流动液体的速度和状态，液体的黏度、样品表面的性质等。,索氏萃取装置和K-D浓缩器,萃取装置,4、萃取剂的选择,1、萃取剂的选择性（极性）2、稳定性、毒性3、沸点：4080者为宜4、萃取剂回收的难易与经济性5、色谱检测器的响应,二、固相萃取(SPE),SPE：SolidPhaseExtraction是一种液相色谱分离，利用固体吸附剂将液体样品中的目标化合物与干扰化合物分离，达到分离和富集目标化合物的目的。,1、固相萃取的模式,反相固相萃取正相固相萃取离子交换固相萃取,阴离子交换阳离子交换,A反相固相萃取,流动相：极性（水溶液）或中等极性固定相：非极性。分离对象：中等到非极性物质。,分析物中的CH键+硅胶表面官能团吸附极性溶液中的有机分析物保留在SPE。用非极性溶剂解吸吸附在固定相中的目标物质。,反相固相萃取原理,常用反相固相萃取柱,LC-18、LC-8：标准的单键合硅胶ENVI-18、ENVI-8：聚合键合类填料ENVI-ChromP：苯乙烯：疏水ENVI-Carb：含碳,B正相固相萃取,流动相：非极性、中等极性固定相：极性。分析物质：极性、中等极性、非极性,正相固相萃取原理,保留取决于分析物的极性官能团与吸附剂表面的极性官能团之间的相互作用。用比样品本身更极性的溶剂洗脱吸附的分析物质。,极性官能团键合硅胶LC-CN，LC-NH2，LC-Diol极性吸附物质LC-Si，LC-Florisil，ENVI-Florisil，LC-Alumina,常用正相固相萃取柱,知识窗,C.离子交换固相萃取,适用于带有电荷的化合物（水溶液、有机溶液）。原理：静电吸引，化合物上的带电荷基团与键合硅胶上的带电荷基团之间的吸引。分为：阴离子交换和阳离子交换。,阴离子（负电荷）交换,LC-SAX、LC-NH2：脂肪族季铵类盐+硅胶,阳离子交换,LC-SCX：磺酸基；LC-WCX：羧酸基团,2、溶剂极性的影响,目标化合物在极性/非极性溶剂中的溶解度，这主要涉及淋洗液的选择。目标化合物有无可能离子化（可用调节pH值实现离子化）。,溶剂极性的影响,目标化合物有无可能与吸附剂形成共价键。在吸附剂上吸附点的竞争程度，关系到能否很好分离。,3、固相萃取的装置及操作程序,固相萃取的装置,固相萃取的装置,固相萃取的装置,操作程序,（1）活化吸附剂萃取之前要用适当的溶剂淋洗小柱，以使吸附剂保持湿润，可以吸附目标化合物或干扰化合物。,（2）上样（吸附）样品倒入活化后的固相萃取小柱，然后利用抽真空，加压或离心的方法使样品进入吸附剂。,（3）洗涤（去除杂质）在样品进入吸附剂，目标化合物被吸附后，可先用较弱的溶剂将弱保留干扰化合物洗掉。,（4）洗脱和收集再用较强的溶剂将目标化合物洗脱下来，加以收集。,我来说！,4、固相微萃取SPME,不是将待测物质全部分离出来，通过在样品与固相涂层间的平衡来达到分离。方法：玻璃纤维浸入样品中残留农药扩散吸附平衡取出玻璃纤维洗脱分析。,固相微萃取装置,固相微萃取装置,关键：石英纤维上涂吸附剂原则：目标化合物是非极性时选择非极性涂层；目标化合物是极性时选择极性涂层。,使用方法,三、超临界流体萃取技术超临界流体萃取技术是以超临界状态下的流体作为溶剂，利用该状态下流体所具有的高渗透能力和高溶解能力萃取分离混合物的过程。,超临界流体物体处于其临界温度和临界压力以上时的状态。气体：粘稠度、表面张力低，溶解能力强，萃取功能高。压力，溶解能力。液体：体积小。,在3540下提取干净的提取方法CO2是一种不活泼的气体。循环使用，降低成本。参数可以调节,特点,流动相,四、微波萃取技术,微波,金属,水分,吸收微波、反射微波、透过微波,频率：300300000MHz的电磁波。穿透：玻璃、塑料、陶瓷等绝缘体。当微波作用于水和酸性物质时，将被极性分子所吸收，因而物质很快被加热。,吸收微波细胞内部温度，细胞内部压力超过细胞壁膨胀承受能力细胞破裂有效成分自由流出。,微波所产生的电磁场加速被萃取部分成分向萃取溶剂界面扩散速率,影响因素,萃取温度的影响萃取溶剂的影响样品杯：聚四氟乙烯,微波萃取被誉为“绿色分析化学”。是因为微波萃取试剂用量少，节能、省时，污染小。使用更少的溶剂，更快的时间，更好的回收率，处理批量大，萃取效率高。,五、超声波辅助萃取,能量外部向内部传递。超声波使溶液形成气泡（空化效应）爆裂温度和压力，增强化学反应能力。,优点：价廉快速，简便安全，批量处理样品。,六、衍生化技术,化学反应定量生成适于分析。,1、衍生化的目的,灵敏度与选择性改善色谱分离：理化稳定性,2、分类,柱前衍生化：为了分离柱后衍生化：为了检测,3、气相色谱的衍生化,（1）硅烷化衍生化方法（2）酯化衍生化方法（3）卤化衍生化方法（4）酚化衍生化方法,方法,（1）硅烷化衍生化方法,利用醇、酚、酸、胺等与硅烷化试剂反应，形成挥发性的硅烷衍生物,（2）酯化衍生化方法,大多数有机酸挥发性、热稳定性差。在GC分析之前衍生为相应的酯。,甲醇法重氮甲烷法三氟乙酸配法,甲醇法,甲醇法有机酸与甲醇在催化剂的存在下加热，可以发生酯化反应，生成有机酸的甲酯,重氮甲烷法,与有机酸反应，生成有机酸的甲酯，重氮甲烷不稳定，有爆炸性，有毒。,（3）卤化衍生化方法,引入卤原子ECD检测器也改善挥发性和稳定性。,卤素的作用是加成或取代,4、液相色谱的衍生化,1.紫外衍生化反应,2荧光衍生化反应,3电化学衍生化反应,（1）紫外衍生化反应,苯甲酰氯+胺、醇、酚苯甲酸酯类衍生物（200-360）,苯甲酰化反应,（2）荧光衍生化反应,在目标化合物上接上能发出荧光的生色基团，如荧光素。,5、制备衍生物的反应罐瓶,农药残留检测是微量或超微量分析，一般可分为化学检测、生化检测和生物检测。当前使用较多的有仪器分析法、免疫分析法、生物传感器法、活体检测法、酶抑制法等。,第三节农药残留检测的常用技术,1、仪器分析,凡是沸点大约在500，分子量在400以下的农药，原则上都可以用气相色谱法分离和分析，目前80以上的农药可以用它检测。我国农药检测现行的国家标准和行业标准多采用气相色谱法。,高效液相色谱法（HPLC）适合于非挥发性、大分子、强极性和热稳定性差的农药的分离分析。,高效液相色谱仪基本装置,流动相,进样阀,注入样品液,色谱柱,检测器,色谱处理机,高压泵,流出液,薄层色谱又叫薄板层析是以涂布于支持板上的支持物作为固定相，以合适的溶剂为流动相，对混合样品进行分离、鉴定和定量、定性的一种层析分离技术。,气相色谱质谱连用二级串联质谱（GC-MS-MS）的联用液相色谱质谱的连用超临界色谱技术高效毛细管电泳毛细管区带电泳法毛细管胶束电动色谱,2、免疫分析法,放射免疫法：是利用同位素标记的方法检测。酶免疫法：是将抗原、抗体的特异性免疫反应和酶的高效催化作用有机结合起来的一种免疫分析方法。荧光免疫法：是利用荧光素标记待测农药进行检测。,3、酶抑制法是将酶加入待测溶液中，根据酶的不同活性，用分光光度计测量吸光值大小，计算农药残留的高低。4、免疫亲和色谱其利用抗原抗体反应的专一性，使分离、净化和浓缩同时进行，一步柱色谱就可使复杂样品提取液中的目标组分得到高纯度与富集。,5、生物传感器法生物传感器通常是指由一种分子识别元件（生物敏感部件）与信号转换器紧密配合，对特定种类化合物或生物活性物质具有选择和可逆响应的分析工具。,分子识别元件：酶、抗体、受体、细胞及组织器官等信号转换器：电极、半导体、光导纤维、压电晶体、表面声波、热敏电阻等,生物传感器,（1）酶生物传感器：（2）免疫生物传感器：利用抗体和抗原之间的免疫化学反应来制作的生物传感器。（3）微生物传感器：利用活微生物的代谢功能检测污染物,换能器（Transducer）,感受器（Receptor）,测量信号（MeasurableSignal）,=分析物（Analyte）,溶液（Solution）,选择性膜（Thinselectivemembrane）,识别元件（RECOGNITION）,生物传感器工作机理,6、流动注射免疫分析法7、活体检测法，8、细菌发光细菌生物发光反应是由分子氧作用，胞内荧光酶催化，将还原态的黄素单核苷酸(FMNH2)及长链脂肪醛氧化为FMN及长链脂肪酸，同时释放出最大发光强度在波长为450-490nm处的蓝绿光。,缺点：细胞发光强度本质差异较大检测期间发光自然变化幅度较宽，重现性不佳，误差较大等。,由于农药品种多、化学结构和性质各异、待测组分复杂，尤其是近年来，高效、低毒、低残留农药品种不断涌现，在农产品和环境中残留量很低，给农药残留检测技术提出了更高的要求。农药残留检测技术朝着快速、方便、灵敏可靠的方向发展。生物技术与现代理化分析手段相结合。,第四节各种农药残留的检测方法,由于农药分析目的各不相同，所以必须采用适合于所要解决问题的具体分析方法。如：特定活性成分残留检测或同一批次产品中任一农药的残留水平。多残留分析方法用来检测和测定系列食品中的多种农药残留，可对多种农药残留量进行评估以确定其是否处于或低于规定的允许残留水平；单一残留分析方法是用于测定单一残留物，而且测定的残留物的主要代谢物和转化产物半定量和定性方法（筛选法）能够估算样品中某种农药的残留水平。,一、食品中有机磷类农残的检测方法,有机磷农药是指在组成上含有磷的有机杀虫剂、杀菌剂等。主要类型有：磷酸酯型，如久效磷、磷胺等二硫代磷酸酯型，如马拉硫磷、乐果、甲拌磷、亚胺硫磷硫酮磷酸酯型，如对硫磷、甲基对硫磷、内吸磷、杀螟松硫醇磷酸酯型，如氧化乐果、伏地松磷酰胺型，如甲胺磷、乙酰甲胺磷膦酸酯型，如敌百虫、苯脯磷,有机磷农药种类很多，按毒性分为高毒（剧毒）、中毒、低毒三类；溶解性：多数难溶于水，可溶于有机溶剂水解性：在碱性介质中易水解氧化性：硫代磷酸酯类在溴、紫外线等作用下其中的S可被O取代。酶抑制活性：可抑制羧酸酯酶、胆碱酯酶的活性,有机磷农药限量,续上表,（一）国标测定方法,实验步骤,1、样品处理选取有代表性的蔬菜样品，去掉不可食部分后称取蔬菜试样，冲洗掉表面泥土，剪成1cm左右碎片。取样品1g，放入烧杯或提取瓶中，加入5mL缓冲液，振荡12min，倒出提取液，静置35min，待用。2、对照溶液测试先于试管中加入2.5mL缓冲液，再加入0.1mL酶液、0.1mL显色剂。摇匀后于37放置15min以上（每批样品的控制时间应一致）。加入0.1mL低物摇匀，此时检液开始显色反应，应立即放入比色皿中，记录反应3min的吸光度的变化值A0。3、样品溶液测定先于试管中加入2.5mL样品提取液，其他操作与对照测定相同，记录反应3min的吸光度的变化值At。,结果计算,抑制率（%）=式中A0对照液反应3min吸光度的变化值；At样品溶液反应3min吸光度的变化值。,酶抑制率法对部分农药的检出限,注意,葱、蒜、萝卜、芹菜、香菜、茭白、蘑菇及番茄汁液中，含有对酶有影响的次生物质，容易产生假阳性。处理这类样品时，可采取整棵蔬菜萃取或采用表面测定法。对一些含叶绿素较高的蔬菜，也可采取整株蔬菜萃取的方法，减少色素的干扰。当温度条件低于37度，酶反应的速度随之放慢，加入酶液和显色剂后放置反应的时间应相应延长，延长时间的确定，应以胆碱酯酶空白对照测试3min吸光度变化差值在0.3以上，即可往下操作。注意样品放置时间应与空白对照溶液放置时间一致才有可比性。胆碱酯酶空白对照测试3min吸光度变化差值在0.3以下的原因：一是酶的活性不够，二是温度太低。,（二）免疫分析技术,酶联免疫分析技术使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。,ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂：固相的抗原或抗体，酶标记的抗原或抗体，酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。双抗体夹心法双抗原夹心法测抗体双位点一步法间接法测抗体竞争法捕获法测IgM抗体应用亲和素和生物素的ELISA,对硫磷的酶联免疫分析,有机磷农药属于小分子物质，必须与大分子联结，才能作为免疫原。免疫抗原的合成,H3-N,重氮化,氨基对硫磷,免疫抗原（载体蛋白）,目前，国外已研制出几十种农药的酶免疫检测试剂盒，包括有机磷类、氨基甲酸酯类、有机氯类、拟除虫菊酯类以及酰胺类等。有机磷20ug/kg氨基甲酸酯类300ug/kg,它具有专一性强、灵敏度高、快速、操作简单等优点，试剂盒可广泛用于现场样品和大量样品的快速检测，可准确定性、定量。但由于受到农药种类多，抗体制备难度大,（二）生物化学测定法,酶抑制活性：可抑制羧酸酯酶、胆碱酯酶的活性。速测卡,速测卡,（1）原理胆碱酯酶可催化靛酚乙酸酯（红色）水解为乙酸和靛酚（蓝色）。有机磷或氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶有抑制作用，使催化、水解、变色的过程发生改变，由此可判断样品中是否由有机磷或氨基甲酸酯类农药的存在。,（2）试剂固化有胆碱酯酶和靛酚乙酸酯试剂的纸片（速测卡）。pH7.5缓冲溶液：分别取15.0g磷酸氢二钠Na2HPO412H2O与1.59g无水磷酸二氢钾KH2PO4，用500mL蒸馏水溶解。,（4）分析步骤整体测定法：选取有代表性的蔬菜样品，擦去表面泥土，1cm左右碎片5g放入带盖瓶中10mL缓冲溶液震摇50次静置2min以上用白色药片沾取提取液放置10min预反应（37，10min，预反应后的药片表面必须保持湿润）将速测卡对折3min使红色药片与白色药片叠合反应。表面测定法（粗筛法）：擦去蔬菜表面泥土滴23滴缓冲溶液表面用另一片蔬菜在滴液处摩擦取速测卡将蔬菜上的液滴滴在白色药片上放置10min将速测卡对折3min使红色药片与白色药片叠合反应。,（5）结果判断以酶被有机磷或氨基甲酸酯类农药抑制（为阳性）、未抑制（为阴性）表示。与空白对照卡比较，白色药片不变色或略有浅蓝色均为阳性结果。白色药片变为天蓝色或与空白对照卡相同，为阴性结果。对阳性结果的样品，可用其它分析方法进一步确定具体农药品种和含量。,（6）注意事项韭菜、葱、蒜、萝卜、芹菜、香菜、茭白、蘑菇及番茄汁液中，含有对酶有影响的次生物质，容易产生假阳性。处理这类样品时，可采取整棵蔬菜萃取或采用表面测定法。对一些含叶绿素较高的蔬菜，也可采取整株蔬菜萃取的方法，减少干扰因素。,部分农药的检出限（速测卡）,符合率：在检出的50份以上阳性样品中，经气相色谱法验证，阳性结果的符合率应该在80以上。,生物化学测定法检测时，蔬菜中的水份、碳水化合物、蛋白质、脂等物质不会对农药残留物的检测造成干扰，不必进行分离去杂，节省了大量预处理时间，从而能达到快速检测的目的。因此该方法具有快速方便、前处理简单、无需仪器或仪器相对简单，适用于现场的定性和半定量测定。,（三）化学方法,1、气相色谱2、有机磷农药速测灵法（金属离子催化显色表面皿法）,1、气谱方法是目前比较权威的方法，可以精确定量，可测出多种不同种类农药。但检测成本高，仪器操作须专业人员，前处理要求较高，时间长。按照国家标准方法GB5009.20-2003,2、有机磷农药速测灵法原理具有强催化作用的金属离子催化剂，使各类有机磷农药（磷酸酯、二硫代酸酯、磷酸胺）在催化作用下水解为磷酸与醇，水解产物与显色剂反应，使显色剂的变色。检测方法：显色液2滴取农药溶液34mL测试皿混匀静置催化液510min观察变化。,主要针对的是有机磷农药的残留检测，特别是甲胺磷、对硫磷农药。这种方法采用化学反应原理，避免了通常所使用生化方法（酶法）的缺点（酶的制备、保存以及反应需比较严格的条件），灵敏度也达到一定的要求,二、氨基甲酸酯类农药的检测,氨基甲酸酯类农药也是一种抑