高变异药物硫酸氢氯吡格雷片的人体生物等效性及饮食影响_李文博

作者简介: 李文博， 男， 硕士研究方向: 体内药物分析和药动学研究 * 通讯作者: 丁黎， 男， 教授， 博士生导师研究方向: 体内药物分 析和药动学研究Tel/Fax: ( 025) 83271485E- mail: dinglihg sina. com 高变异药物硫酸氢氯吡格雷片的人体生物等效性及饮食影响 李文博1， 丁黎1*， 任昱全2， 丁雯1， 吴琰1， 潘虹1( 1. 中国药科大学药物分析实验室， 南京 210009; 2. 维欧医药科技发展有限公司， 上海 201203) 摘要: 目的评价空腹和餐后服用两种硫酸氢氯吡格雷片的生物等效性， 考察饮食对氯吡格雷在中国人体内的药动学影响。 方法针对氯吡格雷的高变异性， 根据文献报道的该药的个体内变异系数等数据计算空腹给药试验所需受试者例数为 70 例; 根据空腹试验的结果计算餐后给药生物等效性试验所需受试者例数为 56 例。两次试验分别采用健康男性受试者进行双周期 双交叉( 清洗期为 7 d) 单次口服受试制剂和参比制剂 300 mg 的试验方法。结果空腹口服受试制剂与参比制剂后， 氯吡格 雷的 max分别为( 5. 78 4. 93) 、 ( 6. 17 6. 76) ngmL 1， t max分别为( 0. 71 0. 33) 、 ( 0. 76 0. 40) h， AUC0- 30 h分别为( 8. 83 6. 72) 、 ( 9. 35 7. 93) nghmL 1， 相对生物利用度为( 107. 3 50. 5) %; 餐后口服受试制剂与参比制剂后， 氯吡格雷的 max 分别为( 30. 9 12. 5) 、 ( 30. 1 13. 3) ngmL 1， t max分别为( 1. 9 0. 6) 、 ( 1. 9 0. 6) h， AUC0- 30h分别为( 65. 0 21. 6) 、 ( 65. 8 22. 3) nghmL 1， 相对生物利用度为( 102. 0 23. 1) %。两种硫酸氢氯吡格雷片之间在空腹和高脂餐给药后药动学参数均 无显著差异( P 0. 05) 。结论对高变异药物氯吡格雷的生物等效性样本量设计合理。受试制剂和参比制剂在空腹给药和 高脂餐后给药情况下均具有生物等效性。与空腹给药相比， 高脂餐后给药， tmax延后1. 2 h， max和 AUC0- 30 h分别增大5 倍和7 倍 左右。 关键词: 高变异; 样本量; 氯吡格雷; 生物等效性; 饮食影响; 液相二级质谱联用 doi: 10. 11669/cpj. 2014. 16. 016中图分类号: 969文献标志码: A文章编号: 1001 2494( 2014) 16 1437 05 Bioequivalence of Highly Variable Drug Clopidogrel Bisulfate and Food Effects on Its Pharmacokinetics LI Wen- bo1， DING Li1*， EN Yu- quan2， DING Wen1， WU Yan1， PAN Hong1( 1. Department of Pharmaceutical Analy- sis， China Pharmaceutical University，Nanjing 210009，China; 2. Vivo Development Ltd， Shanghai 201203，China) ABSTACT:OBJECTIVETo investigate the bioequivalence of clopidogrel bisulfate under fasting and fed conditions and the effect of food on the pharmacokinetics of clopidogrel in chinese volunteers. METHODSBased on the high variability of clopidogrel and its intra- subject variation coefficient data reported in the literatures，the sample size of the bioequivalence evaluation of clopidogrel tablets under fasting condition was estimated and designed to 70 subjects. Based on the fasting test results，the sample size of the bioequiva- lence evaluation of clopidogrel tablets in fed condition was designed to 56 subjects. Both of the studies were designed to the open，ran- domized and crossover tests in which a single oral dose of 300 mg clopidogrel bisulfate tablets was administered to healthy male volun- teers. ESULTSThe pharmacokinetic parameters of clopidogrel in fasting condition for the test and reference tablets were as follows: max( 5. 78 4. 93) vs. ( 6. 17 6. 76) ngmL 1， t max( 0. 71 0. 33) vs. ( 0. 76 0. 40) h， AUC0- 30 h( 8. 83 6. 72) vs. ( 9. 35 7. 93) nghmL 1，and the relative bioavailability of clopidogrel was( 107. 3 50. 5) %; the pharmacokinetic parameters for the test and reference tablets in fed state were as follows: max( 30. 9 12. 5) vs. ( 30. 1 13. 3) ngmL 1， t max( 1. 9 0. 6) vs. ( 1. 9 0. 6) h， AUC0- 30 h( 65. 0 21. 6) vs. ( 65. 8 22. 3) nghmL 1， and the relative bioavailability was( 102. 0 23. 1) %. There were no signif- icant differences in pharmacokinetic parameters between two tablets ( P 0. 05) . CONCLUSIONThe sample size is reasonably de- signed for the bioequivalence of highly variable drug clopidogrel tablets. The test and reference tablets are considered bioequivalent in human. The maxand AUC0- 30 hincrease 5- fold and 7- fold， and tmaxincrease 1. 2 h in fed condition compared to the fasting condition. KEY WODS:highly variable; sample size; clopidogrel; bioequivalence; food effect; LC- MS/MS 硫酸氢氯吡格雷( clopidogrel bisulfate) 临床上 应用于治疗动脉粥状硬化疾病、 急性冠脉综合征、 预 防冠脉内支架植入术后支架内再狭窄和血栓性并发 症等 1- 2 。其在体内的吸收和代谢受多种因素的影 响， 使其药动学以及药效学变异较大3- 4 。对高变异 药物进行生物等效性评价时， 需要较多的受试者例 数才能达到足够的把握度5 。国内在进行氯吡格 雷生物等效性研究时往往忽视对实验所需受试者例 7341 中国药学杂志 2014 年 8 月第 49 卷第 16 期Chin Pharm J， 2014 August， Vol. 49 No. 16 数进行科学计算， 仅仅采用化学药物制剂人体生 物利用度和生物等效性研究技术指导原则 6 建议 的 18 24 例 7- 8 。实际上， 上述指导原则建议的 18 24例受试者是针对“一般情况” 下来说的， 并不 适合于高变异药物的人体生物等效性试验研究。黄 钦等 5 指出， 当个体内变异系数为 30%， 两制剂之 间的评价指标的真实差值为 5%， 样本含量至少应 为 40 例，其等效性评价结论才可以达到 80% 的把 握度， 欲达到 90%的把握度， 则需要至少 54 例。鉴 于硫酸氢氯吡格雷片药动学的高变异性， 本试验在 试验设计阶段， 通过国外相关文献报道的氯吡格雷 制剂人体生物等效性研究所得到的 AUC0- 30 h和 max 的个体内变异系数， 评估硫酸氢氯吡格雷片空腹给 药等效性研究所需受试者例数。又根据空腹试验的 结果， 估算出硫酸氢氯吡格雷片餐后给药生物等效 性研究所需受试者例数。根据上述人体生物等效性 试验受试者例数设计方案， 本试验以 Sanofi Win- throp Industrie 生产的硫酸氢氯吡格雷片为参比制 剂， 评价信东生技股份有限公司生产的硫酸氢氯吡 格雷片的生物等效性， 并首次考察了饮食对氯吡格 雷在中国人体内药动学特征的影响， 为氯吡格雷制 剂的临床用药提供有价值的参考。 1材料与方法 1. 1仪器 Agilent 1260 液相色谱- API4000 质谱联用仪: 含 脱气机、 双高压泵、 自动进样器、 柱温箱、 电喷雾离子 化接口、 三重四极杆质谱检测器以及 Analyst 1. 5. 2 数据处理软件( 美国 Applied Biosystems 公司) ; 电子 天平: Sartorius BP211D( 德国赛多利斯) ， 0416 2 台 式低速离心机， HC 2062 型台式高速离心机， XW 80A旋涡混合器。 1. 2药品与试剂 受试制剂: 硫酸氢氯吡格雷片( 信东生技股份 有限公司， 规格: 每片 75 mg， 批号: 6S2075) ; 参比 制剂: 硫酸氢氯吡格雷片( Sanofi Winthrop Industrie， 规格: 每片 75 mg， 批号: 1A703) 。硫酸氢氯吡格雷 对照 品 ( 中 国 药 品 生 物 制 品 检 研 究 院， 批 号: 100819- 201102， 含量 99. 5%) ， 米非司酮对照品 梯 希爱( 上海) 化成工业发展有限公司， 批号:IQQ7G- EG 。乙腈为色谱纯， 实验用水为去离子纯净水， 甲 酸、 环己烷、 乙醚、 乙酸铵均为市售分析纯。 1. 3色谱与质谱条件 色 谱 条 件:色 谱 柱 为 HederaODS- 2C18 ( 2. 1 mm 150 mm， 5 m， 江苏汉邦科技有限公 司) ; 流动相为乙腈- 5 mmolL 1醋酸铵水溶液( 含 0. 1% 甲酸) ( 73 27， V/V) ; 流速为 0. 5 mLmin 1; 柱温为 35 。 质谱条件: 离子源为电喷雾离子化( ESI) 源; 源 喷射电压为 5 500 V; 温度为 500 正离子方式检 测， 扫描方式为多反应监测( MM) ， 氯吡格雷和米 非司酮的检测离子分别为 m/z 322. 0212. 0 和 m/z 430. 5372. 2。去簇电压( DP) 均为70 V， 碰撞能量 ( CE) 分别为 24 和 35 eV。 1. 4血浆样品的处理 于 10 mL 玻璃离心管中， 精密加入血浆样品 0. 5 mL， 加入内标米非司酮溶液 20 L， 旋涡混匀， 再加入提取溶剂乙醚- 环己烷( 4 1， V/V) 2. 5 mL， 涡 旋 3 min， 于 4 000 rmin 1离心 10 min。取上层有 机相至另一玻璃离心管中， 于25 水浴以氮气流吹 干。空腹试验测定时残渣用 300 L 流动相溶液复 溶， 餐后试验测定时残渣用 900 L 流动相溶液复 溶， 然后转移至 1. 5 mL 塑料离心管中， 16 000 rmin 1离心 3 min， 取上清液至自动进样器样品瓶 中， 进样量 10 L， 进行 HPLC- MS/MS 分析。 1. 5空腹给药试验设计 1. 5. 1受试者例数的确定生物等效性研究中受 试者例数的确定一般由 4 个因素决定 9 : 显著性 水平; 把握度; 两药生物等效性检测指标的变异 性; 两药生物等效性检测指标的差别。本试验在 试验设计阶段， 通过 A. Filipe 等、 Teva 公司、 MY- LAN 公司等 10- 13 报道的空腹服用氯吡格雷制剂的 个体内变异系数等参数， 在把握度为 80% 的情况下 利用 DAS3. 2 软件估算了氯吡格雷片空腹给药等效 性研究所需受试者例数( 表 1 中项目名为 Sample size estimated by CV% of max及 Sample size estimated by CV% of AUC 的项下内容) ， 具体数据结果见表 1。其中 MYLAN 公司的96 例等效性试验 11 可能由 于试验控制、 制剂、 个别受试者变异较大等原因使其 变异系数较大， 导致估算的受试者例数远超其他试 验。结合文献选择的受试者例数， 考虑到试验中受 试者脱落等情况， 最终确定本试验硫酸氢氯吡格雷 空腹给药等效性试验所需受试者例数为 70 例。 1. 5. 2空腹给药试验方案硫酸氢氯吡格雷片空 腹给药生物等效性试验经过第四军医大学第一附属 医院药物临床试验伦理委员会同意后实施。70 名 男性 健 康 志 愿 者， 年 龄 ( 26. 6 2. 8)岁， 体 重 ( 65. 1 2. 3)kg， 身高( 172. 2 2. 7)cm， 体重指数 8341 Chin Pharm J， 2014 August， Vol. 49 No. 16中国药学杂志 2014 年 8 月第 49 卷第 16 期 表 1文献报道的氯吡格雷药动学参数的个体内变异以及估算的所需样本量 Tab. 1The intra- subject CV% of pharmacokinetic parameters of clopidogrel reported in the literatures and the sample size estimated by CV % eferencesA. Filipe10 MYLAN11 MYLAN12 Teva13 Intra- subject CV of max( %)40. 7 54. 644. 147 Intra- subject CV of AUC ( %)31. 043. 330. 941 Sample size applied in the literatures649664100 Sample size estimated by CV% of max643506474 Sample size estimated by CV% of AUC407484056 ( 21. 9 0. 6)kgm 2， 无既往病史和药物过敏史， 精神状态良好， 不吸烟， 不嗜酒， 试验前两周内未服 用任何药物， 试验前血常规、 肝功能、 肾功能及心电 图检查结果均属正常， 志愿者在实验前均签署知情 同意书。给药方案为单剂量口服、 随机、 开放、 双周 期交叉。70 名男性健康受试者随机分为 2 组， 分别 口服受试制剂和参比制剂， 7 d 后交叉给药。服药 前 1 d 晚上食用清淡食品， 试验前禁食至少 10 h， 正 常饮水， 受试当天 7: 00 am 服药， 用 250 mL 温水送 服。于用药前 ( 0 h)及给药后 0. 17、 0. 33、 0. 5、 0. 75、 1、 1. 5、 2、 3、 4、 6、 8、 11、 14、 24、 30 h 采集受试者 肘静脉血4 mL。 1. 6餐后给药试验设计 1. 6. 1受试者例数的确定以 AUC0- 30h和 max计算 硫酸氢氯吡格雷片空腹给药等效性试验的体内变异 系数分别为 30% 和 24. 9%， 在把握度为 80% 情况 下， 利用 DAS3. 2 软件估算硫酸氢氯吡格雷片餐后 给药等效性试验所需受试者例数分别为 56 例( 以 AUC0- 30 h计算) 和 32 例( 以 max计算) 。为了确保试 验的把握度， 最终确定硫酸氢氯吡格雷片餐后给药 等效性试验受试者例数为 56 例。 1. 6. 2餐后给药试验方案硫酸氢氯吡格雷片餐 后给药生物等效性试验经过中南大学湘雅三医院药 物临床试验伦理委员会同意后实施。56 名男性健 康志愿者， 年龄( 22 3) 岁， 体重( 61. 5 6. 5) kg， 身 高( 170 5) cm， 体重指数( 21. 2 1. 7) kgm 2 ， 无 既往病史和药物过敏史， 精神状态良好， 不吸烟， 不 嗜酒， 试验前两周内未服用任何药物， 试验前血常 规、 肝功能、 肾功能及心电图检查结果均属正常， 志 愿者在实验前均签署知情同意书。给药方案为单剂 量餐后口服、 随机、 开放、 双周期交。56 名男性健康 受试者随机分为 2 组， 分别口服受试制剂和参比制 剂， 7 d 后交叉给药。给药前禁食至少 10 h。次日 早晨进食高脂高蛋白餐( 肯德基培根芝士蛋堡两 个、 牛奶 250 mL) ， 用餐时间控制在 30 min 内用， 高 脂餐进食开始 30 min 后给药， 250 mL 温开水送服。 于服药前( 0 h) 和服药后 0. 25、 0. 5、 0. 75、 1、 1. 5、 2、 2. 5、 3、 4、 6、 8、 11、 15、 24、 30 h 从肘静脉取血 4 mL。 1. 7数据统计 血药浓度经 DAS3. 2 统计计算软件处理， 计算 药动学参数及相对生物利用度， 并评价受试制剂与 参比制剂是否生物等效。 2结果 2. 1氯吡格雷测定方法评价 专属性以及介质效应试验表明， 空白血浆中没 有内源性物质干扰药物及内标的测定; 低、 中、 高 3 中浓度的平均提取回收率均在 85% 左右; 所有质控 样品的日内、 日间精密度 SD 均小于 7. 9%， ; 稳定 性考察结果均符合试验要求。由于餐后给药试验中 氯吡格雷的血药浓度是空腹给药试验的数倍， 所以 2 次试验设计了不同的线性范围。空腹给药试验的 标准曲线的线性范围为 3. 504 10 3 16. 02 ng mL 1; 餐后给药试验的标准曲线的线性范围为 0. 014 92 49. 75 ngmL 1。将配制的标准含药血 浆按 “ 1. 4” 项下处理进行 LC- MS/MS 分析， 记录氯 吡格雷峰面积 As 和内标峰面积 Ai， 以峰面积比值 f ( As/Ai) 对氯吡格雷血药浓度( ) 作权重回归计算， 分别得到权重回归方程: f = 0. 266 + 3. 29 10 4 ( r =0. 999 7) 和 f =0. 304 + 1. 40 10 4( r =0. 999 7) ， 权重系数为 =1/2。结果表明， 氯吡格雷在 2 个线性范围内均具有良好的线性。方法验证结果表 明， 本定量方法灵敏、 准确， 适合氯吡格雷的临床血 药浓度分析。 2. 2药动学和生物等效性评价结果 70 名中国健康男性志愿者空腹口服硫酸氢氯 吡格雷片300 mg 后平均血药浓度- 时间曲线见图 1， 主要药动学参数见表 2。56 名中国健康男性志愿者 餐后口服硫酸氢氯吡格雷片 300 mg 后平均血药浓 度- 时间曲线见图 1， 主要药动学参数见表 2。分别 将空腹给药和餐后给药后参比制剂以及受试制剂的 AUC0- 30 h、 AUC0- 和 max经对数转换后进行方差分 9341 中国药学杂志 2014 年 8 月第 49 卷第 16 期Chin Pharm J， 2014 August， Vol. 49 No. 16 析， tmax进行非参数法检验， 结果显示， 两制剂在空腹 给药以及餐后给药条件下的 AUC0- 30 h、 AUC 0- 、 max 和 t max均无显著差异( P 0. 05) 。进一步采用双单 侧检验和( 1- 2) 置信区间法分析， 结果表明， 两种 氯吡格雷制剂具有生物等效性， 结果见表 3。 2. 3饮食影响 比较表 2 中空腹给药与餐后给药的药动学参 数， 可见餐后给药氯吡格雷的达峰时间 tmax推迟了 1. 2 h， 达峰浓度 max增大了5 倍左右， 药物的暴露量 图 1健康受试者空腹( A， n =70) 与餐后( B， n =56) 口服受试 制剂与参比制剂的平均血药浓度- 时间曲线. 珋xs Fig. 1Mean plasma concentration- time curves of test and refer- ence formulations after a single dose of clopidogrel under fasting ( A， n =70)and fed conditions( B， n =56)in healthy male vol- unteers. 珋x s 表 2空腹和餐后给药氯吡格雷的主要药动学参数 . 珋 x s Tab. 2Pharmacokinetic parameters of clopidogrel after a single dose of test and reference formulation under fasting and fed con- ditions. 珋x s Parameters Fasting condition( n =70)Fed condition( n =56) TesteferenceTesteference t1/2/h 6.7 1.96.9 1.87.4 2.47.8 2.4 tmax/h 0.71 0.330.76 0.401.9 0.61.9 0.6 max/ ngmL15.78 4.936.17 6.7630.9 12.530.1 13.3 AUC0- 30 h/nghmL18.83 6.729.35 7.9365.0 21.665.8 22.3 AUC 0- /nghmL18.94 6.759.46 7.9865.7 21.966.6 22.8 表 3空腹和餐后给药氯吡格雷药动学参数的 90% 置信 区间 Tab. 390% Confidence intervals for relevant pharmacokinetic parameters stateparameters AUC0- 30 hAUC 0- max Fast atio/%97.997.9100.6 90% CI90% 106.6%90% 106.5%93.8% 108% Intra- subject CV30.0%30.0%24.9% Fed atio/%99.499.3104.3 90% CI94.5% 104.6%94.4% 104.6%96.1% 113.1% Intra- subject CV16.1%16.1%25.7% AUC0- 30 h增大了 7 倍左右， 说明饮食对氯吡格雷的药 动学存在显著影响。与国外报道 14- 15 的饮食对氯 吡格雷的药动学影响的结论一致。 3讨论 高变异药物进行生物等效性研究时， 如果受试 者例数设计过少则可能出现假阴性的现象， 将生物 等效的 2 个药品误判成不等效 9 。例如: Teva 公 司 13 在进行氯吡格雷生物等效性研究时， 对于同一 受试制剂和参比制剂设计了样本量分别为 100 以及 16 例的等效性试验， 结果样本量为 100 例的试验的 AUC0- t和 max比值的 90% 置信区间分别为 95. 3% 99. 6%、 88. 1% 105. 0%， 判定两制剂生物等效， 而 样本 量 为 16 的 试 验 的 90% 置 信 区 间 分 别 为 79. 0% 127. 4%、 67. 32% 100. 8%， 则误判两制 剂生物不等效。根据本文硫酸氢氯吡格雷片空腹给 药等效性试验的体内变异系数( 表 3) ， 用 DAS3. 2 软件估算空腹试验所需最大样本量为 56 例， 表明空 腹试验受试者例数设计合理。统计本试验硫酸氢氯 吡格雷片餐后给药等效性药动学数据， 发现餐后给 药使氯吡格雷制剂的个体内变异显著减小( 表 3) ， 原因可能是饮食抑制了其他导致氯吡格雷人体药动 学高变异的因素， 降低了氯吡格雷的体内变异性。 对于高变异的药物除了增大样本量以外还可以采取 重复交叉设计以及多剂量稳态评价等方法。总之， 在对高变异药物进行生物等效性评价时要考虑到试 验结果的可信性， 要达到生物等效性评价要求的把 握度。 不同制剂之间由于处方工艺的不同， 食物对其 生物利用度的影响亦可能不同。如果没有开展餐后 生物等效性研究， 则很难预测食物对制剂生物利用 度影响的相对趋势和程度， 以及对生物等效性证据 的影响 16 ， 所以本试验开展了硫酸氢氯吡格雷片餐 后等效性试验。在设计餐后等效性试验时， 考虑到 0441 Chin Pharm J， 2014 August， Vol. 49 No. 16中国药学杂志 2014 年 8 月第 49 卷第 16 期 饮食会导致达峰时间推迟， 根据化学药物制剂人 体生物利用度和生物等效性研究技术指导原则 6 的要求， 峰浓度附近至少需要 3 个采样点， 所以推迟 了吸收相的采样时间点， 增设了给药后 2. 5 h 的采 样点。试验结果表明， 与空腹给药相比， 餐后给药氯 吡格雷的达峰浓度 max与药物的暴露量 AUC0- 30 h显 著增大， 结果见表 2。而导致 max与 AUC0- 30 h增大的 原因可能有以下几点: 餐后肝的血流量增大， 减弱 了氯吡格雷的肝首过效应; 食物影响了氯吡格雷 的肠代谢情况， 使氯吡格雷的肠代谢减弱; 氯吡格 雷为弱碱性药物， 主要在小肠吸收， 饮食会使肠液的 pH 减小， 提高了氯吡格雷的溶解性， 增大了它的溶 出度， 提高了氯吡格雷的吸收量。这些研究结果为 硫酸氢氯吡格雷片在中国人体内临床上安全合理用 药提供重要的参考依据。 EFEENCES 1ZHAGN Q S， ZOU J， ZHAO D， et al. esearch progress of a new antiplatelet agent- clopidogrelJ. 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