核医学-第6章体外分析

第六章 体外分析技术,【目的要求】掌握放射免疫分析、免疫放射分析的原理及异同点。非放射性标记免疫分析技术有哪些？体外标记免疫分析的基本试剂和基本技术。何为受体的放射性结合分析？主要优缺点？,20世纪60年代RIA创始人Yalow和Berson于1977年获诺贝尔医学奖,体 外 分 析,定义：以放射性核素或其它非放射性物质标记的配体为示踪剂，以配体和结合体的结合反应为基础，在试管内进行的微量生物活性物质的检测技术。,体外分析技术,体外放射分析,体外非放射分析,放射性竞争结合分析,放射性非竞争结合分析,放射免疫分析 (radioimmunoassay, RIA),免疫放射分析,酶标记免疫分析,化学发光免疫分析,时间分辨荧光免疫分析,(immunoradiometric assay, IRMA),(EIA),(CLIA),(FIA),分类:,第一节 放射免疫分析基本原理,以抗原抗体间的免疫反应为基础的分析技术放射免疫分析(Radioimmunoassay,RIA)是以抗原抗体的免疫反应为基础，利用待测抗原与定量的标记抗原同限量的特异性抗体竞争性结合，以放射性测量为微量定量手段，获得待测生物样品中抗原浓度的技术。,放射免疫分析（RIA）的基础是放射性核素标记的抗原和非标记抗原（标准抗原或被测抗原）同时与限量的特异性抗体进行竞争性免疫结合反应，其竞争关系可用下式表示：式中：*Ag为标记抗原，Ag为非标记抗原，Ab为特异性抗体，*Ag-Ab为标记抗原抗体复合物，Ag-Ab为非标记抗原抗体复合物。,RIA操作过程,1、在试管内加入特异抗体(Ab)和待测样品(待测物Ag或标准抗原Ag) ，给予一定的时间使抗原抗体反应。 2、加人标记抗原(*Ag)，给予充分的时间使抗原抗体反应。血清样品或标准品中的Ag能抑制*Ag与Ab的结合。 3、分离游离抗原(*Ag)和抗原抗体复合物(*Ag-Ab)。 4、用r计数器测定抗原抗体复合物(*Ag-Ab)的放射性B。 5、用呈梯度浓度的已知含量的标准品制作标准曲线(F(F+B) or(F)or B(F十B)or Bor BBo 。从待测样品的结合率从标准曲线查找或通过计算机函数拟合求得待测样品的含量。,RIA法的原理,是以抗原抗体的免疫反应为基础。以放射性核素标记的抗原为示踪剂，以非标记抗原(标准抗原或待测抗原)为检测对象，共同与限量的特异性抗体进行竞争性免疫结合反应。由于标记抗原与抗体的结合量与非标记抗原的含量之间，存在竞争抑制的函数关系，可依据反映这一函数关系的标准曲线，求出被测抗原的含量。其竞争关系可用下式表示：,Ag*与Ag由于免疫化学性质一致(免疫活性相同)，Ag*与Ag共同竞争性与Ab结合，Ag*和Ab为恒量，Ag*与Ag之和大于Ab的分子数，Ag与Ag*.Ab复合物之间呈负相关关系。,二、放射免疫分析法的基本试剂,抗体、标记抗原、非标记标准抗原(标准品)是放射免疫分析方法所需的基本试剂,(一)抗体 衡量抗体质量的指标有：抗体的亲和力，抗体的特异性，抗体的滴度。亲和力高、特异性强的抗体才能建立高灵敏度和高特异性的放射免疫分析方法。,抗体的亲和力表示抗体与抗原结合的能力，亲和力高，抗原抗体易结合和结合后不易解离。特异性表示抗体与抗原结构类似物不易发生交叉反应的程度，如果抗体特异性不高，则抗原类似物也能与抗体结合，成为干扰物质，影响分析结果。滴度(titer)是指抗体实际应用时的稀释倍数，滴度越高，所需的抗血清量就越少血清的稀释倍数越高，抗血清中杂质干扰也越少。但通常滴度高到1：1000以上，血清中干扰物质影响就很小,（二）标记抗原,放射免疫分析法目前使用的标记抗原多数是用125I标记，少数不易用125I标记的抗原可采用3H标记。125I标记抗原用普通的r探测器测量，方法简便，成本较低廉，3H标记样品要用液体闪烁计数器测量，测量费用较高。,对标记抗原的主要要求是：,标记后不改变原有抗原的生物活性(免疫活性、特异性等)；标记的放射性核素的半衰期不能太短，以能保证商品试剂盒的制造、运输和完成整个分析过程所需，125I半衰期为60d，符合以上要求； （3H半衰期为12.3年）比活度和放化纯度必须足够高，以保证放免分析的灵敏度。,（三）标准品(stalldard),标准品是已知含量并呈梯度浓度的系列标准抗原，做标准曲线用。对标准品的要求和其他定量分析方法相同。但必须注意的是标准抗原既作为含量的标准，又要参加免疫反应，必须保证与待测物具有相同的免疫活性和相同的介质(一般应溶解于不含待测物的血清或体液中)。,（四） 分离方法和数据处理,分离的目的是反应达到平衡后，使抗原抗体复合物和游离抗原分开，以便分别测量其放射性B和F。游离抗体及非标记抗原无放射性，不干扰测量。抗原抗体复合物是大分子，游离抗原是小分子，因而凡是能使大分子和小分子物质分离的方法均适用 .,1、聚乙二醇(PEG)沉淀法。使含有B与F的反应液的pH值处于球蛋白的等电位点，加入适当浓度的沉淀剂，如聚乙二醇（PEG），夺取球蛋白周围的水分子，使它失去水化层，从而将其（包括B）沉淀下来，并与F分离。本法操作简便，分离速度快，价格低廉，但分离效果易受pH值、离子强度和温度的影响，且非特异性结合较高。,2、双抗体沉淀法。抗体与抗原反应结束后，加入抗第一抗体的抗体(称第二抗体，常用产生第一抗体的动物的免疫球蛋白作为抗原免疫另一动物得到，例如羊抗兔二抗)，形成抗原一第一抗体一第二抗体的复合物，易于沉淀。3、双抗体沉淀法常与聚乙二醇(PEG)沉淀法联合使用，能增加复合物沉淀分离效果。,4、收集游离抗原测量放射性(F),常用的是活性炭吸附法。活性炭能吸附小分子游离抗原，离心后复合物留在上清液，游离抗原沉在沉淀中供测量。本法易于解离，需严格控制时间及温度。用葡聚糖包被活性炭(称DCC)，由于葡聚糖的分子筛作用，则能增强吸附效果和减少解离，较常使用。若将活性炭和氧化铁连接后制备DCC，最后可用磁场代替离心法将DCC与上清液分离,5、固相法将抗体吸附在某种固体支持物或反应试管壁上，试验时充分振荡并给予一定的时间使抗原抗体反应充分进行，达平衡后抗原抗体复合物就留在支持物上，只需将剩余的反应液弃去，再洗涤数次，测定固体支持物上的放射性B。很多材料可供选用作为固体支持物，如塑料、纤维素、凝胶颗粒、多孔玻璃微球等。,放射免疫分析的基本技术,分离技术测量技术数据处理,测量-闪烁计数器,标准曲线的拟合方式,标准曲线是衡量待测样品中配体浓度的客观尺度，也是反映检测质量的指标。标准曲线要最大限度地反映量、效关系，便于自动化分析，使用灵活。每一批分析必须做一条标准曲线。,常用的方法有,log-logit坐标系及线性回归法：是目前公认比较好的拟合方法，它是以结合率的logit值为纵坐标，以标准品浓度的对数值为横坐标，制成散点图，然后用最小二乘法对各散点进行直线回归，得出回归方程，获得标准曲线，可用计算机或计算器完成。,质量控制,目的：对整个分析过程中的任何环节造成的误差进行经常性的检查，以保证分析误差控制在可接受的范围内。,27,1. 室内质控检测系统性能评价,零标准管结合率（B0%） 最大结合率，30%50%，特异性抗体稳定性指标。,28,非特异性结合率（NSB%） 5%10%。NSB%增高，测定结果的假阳性率增高。,最低浓度管和最高浓度管的结合率之差应大于30%。,标准曲线回归参数 截距a，斜率b值稳定，r0.99。斜率越大，灵敏度越高，但可测范围相对变小。,ED25、ED50、ED75 结合率在25%、50%、75%时对应的抗原浓度值，反映标准曲线的稳定性，有助于批间结果的比较。,质量控制图,警告：12S失控：13S、22S,30,1.精密度（precision） 变异系数（ CV ）5%10%,2.准确度（accuracy） 回收率=测定值/真实值100% 90%110%,3.灵敏度 （sensitivity） 方法的最小可测量,4.特异性（specificity） 交叉反应率,5.可靠性（validity） 平行性试验,6.稳定性（stability） B0%，NSB，ED25，ED50，ED75,RIA质量控制常用指标,31,室间质量评价,寻找误差产生的原因，改进分析工作质量,向主管部门提供信息，改进方法、试剂盒，促进实验室内部质量控制,RIA优点,1、灵敏度高（可达到10-1210-15克，）；2、特异性强（良好的特异性结合试剂能识别化学结构上非常相似的物质，甚至能识别出立体异构体）；3、操作简便（所需试剂品种不多；标本一般不需高度纯化；加样程序简单；反应时间不长；测量和数据处理易于实现自动化）；4、应用范围较广（目前至少有300多种生物活性物质已建立了竞争性放免分析法）等优点。,第二部分 免疫放射分析法(Immunoradiometric assay,IRMA),原理：将过量的标记抗体与抗原结合，分离结合的标记抗体与未结合的多余的标记抗体，测定复合物的放射性，其活度与待测抗原的量呈正相关。,免疫放射分析法操作,拟合的标准曲线,拟合的NSB,IRMA的标准曲线及非特异结合曲线,1. 单位点法,35,IRMA的主要分离方法,先将待测抗原与过量的125I标记抗体充分结合，形成抗原- 125I标记抗体复合物，然后加入固相抗原（抗原包被珠）与反应体系中游离的125I标记抗体结合，测定反应体系中液相的放射性。,双位点IRMA的分离方法,双抗夹心法:（最常用） 将分离抗体涂在反应容器的壁上，称固相抗体。固相抗体先于抗原反应，形成固相抗体抗原复合物，再与标记抗体反应，形成固相抗体抗原标记抗体复合物附着在管壁上，倾去上清液直接测量反应容器的放射性。,37,3.标记第三抗体法（labeled third antibody method）,夹心法中原来的标记抗体Ab2不再标记，而标记的第三抗体则是针对Ab2抗体的，即用Ab2抗体（若抗鼠）作为抗原去免疫兔（或羊）而得到的抗体。因此，Ab3抗体具有多用性。,38,4.双标记抗体法（double labeled antibody method）,利用抗原有多个抗原决定簇，在单抗制备上筛选出3个以上的特异性McAb，其中一个涂饰在固相上，其余两个分别进行125I标记，这样的复合物比活度高，利于提高灵敏度和精密度。,免疫放射分析法特点：,1以标记抗体作为示踪剂2反应动力学：因标记抗体是过量的，且反应是非竞争性的，抗原抗体是全量反应，故反应速度比RIA快。3灵敏度明显高于放射免疫分析，约为放射免疫分析的10100倍。4标准曲线工作范围宽。5特异性高。6稳定性好。,反应速度快：IRMA为非竞争性反应，且抗体是过量的，反应速度快，反应容易达到平衡，温度变化对结果影响不大。,40,（三）IRMA的优点,特异性强：由于使用的是单克隆抗体，所以特异性一般比较高。,灵敏度高：理论上比RIA高出10100倍。但是要求有良好的分离方法的保证。,稳定性好：标记的是抗体IgG蛋白分子，含有多个酪氨酸或组氨酸残基，标记方法简单，稳定性好。,需要特殊的分离方法，目前还主要限于蛋白质和多肽抗原，很多小分子半抗原和短肽还不能应用。 由于IRMA中要分离的是游离抗体和抗原抗体复合物，都属于大分子，非特异的分离方法很难奏效。主要是靠单克隆抗体作为分离剂，因此在IRMA系统中需要两种抗体，至少需要两个抗原决定簇，对小分子的半抗原不合适。,41,（四）IRMA的缺点,RIA与IRMA的异同,均为以抗原抗体的免疫反应为基础，测定对象为物质的抗原；,IRMA和RIA的区别,1. 反应机制不同： RIA是竞争性反应；IRMA是非竞争性反应2. 反应试剂： RIA主要试剂有三种，标记的是抗原； IRMA主要试剂只有两种，标记的是抗体。,3. 分离方法不同： IRMA需要2个或2个以上的抗原决定簇； RIA只需要一个抗原决定簇。4. 剂量关系： 待测抗原复合物的放射性在RIA中与待测抗原的量呈负相关； 在IRMA中呈正相关。,5. 反应中的NSB： 在RIA主要影响高剂量反应； 在IRMA中主要影响低剂量反应。,拟合的标准曲线,拟合的NSB,拟合的标准曲线,拟合的NSB,IRMA的标准曲线及非特异结合曲线,RIA的标准曲线及非特异结合曲线,IRMA与RIA工作原理的主要区别,第三部分 非放射性标记免疫分析技术,主要的非放射性标记物有荧光标记，化学发光标记和酶标记等,酶免疫测定技术是以酶标记的抗体或抗原为主要试剂的方法，利用酶促作用使底物反应，利用酶使底物显色的作用而使酶的作用得到放大，从而建立的高灵敏度的分析方法。 这种用酶分子代替放射性核素标记抗原或抗体分子，进行竞争性或非竞争性免疫分析的技术，统称酶免疫分析技术。 其中应用最多且被认为最有发展前途的是酶联免疫吸附分析法。ELISA最初曾用于竞争免疫分析.。,（磁性微球）固相抗体-抗原-标记抗体,化学发光免疫分析技术是基于化学发光反应和免疫反应建立起来的免疫分析技术，它既具有免疫反应的高特异性，又具有化学发光的高敏感性。其免疫反应的基本原理与放射免疫分析和酶标记免疫分析技术几乎完全相同，其区别仅在于标记物化合物的不同，因而测定方法各异。,49,二、化学发光免疫分析技术,化学发光免疫分析(CLIA),CLIA是用能产生化学发光的化合物代替放射性标记物，其他步骤和RIA或IRMA基本相同。最常用的发光化合物是异鲁米那和甲基氮蒽。它们在碱性条件下遇到过氧化物便发生单光子发射，光子的数量和异鲁米那或甲基氮蒽的量呈正比，而异鲁米那或甲基氮蒽的量是反映复合物的量。这种方法的主要缺点是发光时间集中在加人过氧化物或碱的短时间内，必需严格掌握测量时间,化学发光酶免疫测定(CLEIA),抗原抗体反应步骤均与酶免疫测定相同，不同之处在于酶反应所用底物为发光剂，酶促作用使底物发光，通过化学发光反应发出的光在特定的仪器上进行测定，从而定出待测物的量。两种常用的标记酶，辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(AP)均有其发光底物，由此建立的CLEIA均已在体外分析临床中,电化学发光免疫测定(ECLI),在ECLI中应用电化学发光反应的底物三联吡啶钌作为标记物，标记方法是将其衍生物N羟基琥珀酰胺(NHS)酯可通过化学反应与抗体或不同化学结构的抗原分子结合，制成标记的抗体或抗原。ECLI的测定模式与ELISA相似，分两个步骤进行。,（磁性微球）固相抗体-抗原-标记抗体,时间分辩荧光免疫分析技术 时间分辨荧光免疫分析技术是利用稀土元素（镧系元素）作为标记物。镧系元素在紫外线的激发下可以持续的发射出一定波长的荧光光子，而其他波长的光子寿命较短，待其他光子衰减后探测特定波长的特异性荧光光子就可以检测复合物的量。,第四节 体外标记免疫分析的临床应用 国内常用的测定项目一览表,总甲状腺素（TT4） 65169 nmol/L 甲亢；甲减 总三碘甲状腺原氨酸（TT3） 1.13.0 nmol/L 甲亢；甲减 游离甲状腺素（FT4） 10.325.7 pmol/L 甲亢；甲减。结果不受TBG容量影响 游离三碘甲状腺原氨酸（FT3） 2.26.8 pmol/L 甲亢；甲减。结果不受TBG影响 促甲状腺激素（TSH） 010 mIU/L（RIA法） 0.43.6 mIU/L（IRMA法） 原发性甲减；继发性甲减；甲亢 3,3,5-三碘甲状腺原氨酸（rT3） 0.431.15 nmol/L 甲亢；甲减；低T3综合征 抗甲状腺球蛋白抗体（TGAb） 30% 慢性淋巴细胞性甲状腺炎 抗甲状腺微粒体抗体（TMAb） 15% 慢性淋巴细胞性甲状腺炎 促甲状腺素受体抗体（TRAb） 13 U/L Graves病,皮质醇（Cortisol） 8AM13.877.3 nmol/L 4PM为清晨分泌的1/2 皮质醇增多症；肾上腺皮质功能低下 生长激素（GH） 男 0.340.3 g/L 女 0.840.98 g/L 肢端肥大症、巨人症；垂体性侏儒 胰岛素（Insulin） 424 mU/L 糖尿病分型诊断；胰岛细胞瘤 C肽（C-peptide） 0.71.7 g/L 低血糖病因诊断，使用胰岛素治疗患者胰岛细胞功能判断 胰高血糖素（Glucagon） 386 ng/L 胰高糖素瘤特异诊断；糖尿病研究 肾素（RA） 62.128.7 ng/L 立位 1.953.99 g/L 卧位 0.050.79 g/L 促胃液素瘤特异诊断；消化系统疾病研究 高血压分型诊断；继发性醛固酮增多症；原发性醛固酮增多症 血管紧张素II（AII） 立位 55.3115.3 ng/L 卧位 28.252.5 ng/L 同上 醛固酮（Ald） 立位65.2295.7 ng/L 卧位60173.9 ng/L 原发性醛固酮增多症；肾性高血压；肾上腺皮质功能减退,孕酮（P） 促卵泡激素（FSH） 促黄体囊生成激素（LH） 睾酮（T） 泌乳素（PRL） E2,2-微球蛋白（2-MG） 2.0 mg/L 肾小球受损，恶性肿瘤。 铁蛋白 男性 20240 g/L 女性 16132 g/L 缺铁性贫血；肝癌、急性白血病。 甲胎蛋白（AFP） 20 g/L 原发性肝癌、卵巢内胚窦癌；胎儿发育情况监测。癌胚抗原（CEA） 15 g/L 消化道肿瘤、肺癌、乳腺癌 CA199 37 U/ml 胰腺癌 CA50 15 U/ml 卵巢上皮细胞癌；子宫内膜异位症 CA125 35 U/ml 胃肠道恶性肿瘤 CA153 28 U/ml 乳腺癌,选择题1,放射免疫分析的基本原理是：A.标记抗原和非标记抗原与过量的特异性抗体进行竞争性结合反应B.标记抗原与限量的特异性抗体进行结合反应C.标记抗原和非标记抗原与限量的特异性抗体进行竞争性结合反应D.标记抗原与限量的特异性抗体进行竞争性结合反应E.标记抗原与过量的特异性抗体进行结合反应,选择题2,免疫放射分析的基本原理是：A. 抗原与过量的特异性标记抗体进行结合反应B.标记抗原与过量特异性抗体进行结合反应C. 抗原与限量的特异性抗体进行结合反应D.标记抗原和非标记抗原与限量的特异性抗体进行竞争性结合反应E.标记抗原与限量特异性抗