T4连接酶说明书

T4 DNA 连接酶SinoBio目录号：M001近岸蛋白质科技有限公司地址：上海市浦东新区张江高科技园区蔡伦路720号2号楼 电话邮箱：产品描述：T4 DNA连接酶常用于催化双链DNA平末端或互补粘性末 端之间的连接反应，也能催化双链RNA 5-磷酸末端和3-羟基 末端间的连接。还可以修复双链DNA、RNA或DNA/RNA杂 交双链中的单链切口。以上反应均需消耗ATP。保存温度：-20oC 产品包装：T4 DNA连接酶 （350U/l） 2Quick Ligation Buffer 10T4 DNA Ligation Buffer 80l 1ml 1ml特点：随 酶附带10T4 DNA Ligation Buffer及独特配方的2 Quick Ligation Buffer提供给您更多的选择：而使用10T4 DNA Ligation Buffer，16过夜连接可获得最高的连接效率； 使用快连buffer在室温(25)下，仅需5分钟即可完成粘性末 端或平滑末端DNA片段的连接反应。质量保证：经多次柱纯化，SDS-PAGE胶检测仅可见清晰单一的目的 条带；PCR方法检测无大肠杆菌DNA残留，无核酸内、外 切酶污染。活性定义：在20 ml的连接反应体系中, 6 mg的DNA-Hind III的分解 物在16下反应30分钟时, 有90%以上的DNA片段被连接 所需要的酶量定义为1个单位。产品用途：DNA片段和载体DNA的连接。（参见欣百诺实验方 案）。 DNA片段和Linker或Adaptor DNA的连接。快速连接步骤：1） 取50 ng载体和3倍摩尔量的插入片段，用双蒸水调整总 体积为10 l。 2）加入10 l 2Quick Ligation Buffer，混匀。 3）加入0.5-1 l T4 DNA连接酶，充分但轻柔混匀（切勿剧 烈震荡，可能导致酶部分失活）。 4）稍事离心，置于室温 (25) 作用5分钟。 5）冰上放置，转化（如不立即进行转化实验请冻存 于-20）使用建议：粘 末端的连接反应: 插入片段和载体的摩尔浓度比特别重 要，此比例在2-6之间最好，低于2:1就会导致较低的连接效 率，高于6:1则会导致多个插入。摩尔比请按载体与插入片段 DNA浓度及分子大小来计算。 平滑末端的连接反应： 平滑末端的连接反应与突出末端 相比反应较慢(其Km值约为突出末端的100倍)。进行平滑末 端的连接反应时，可提高DNA浓度，将使用酶量增加到突出 末端量的25倍左右。 向粘粒或噬菌体进行连接反应：可使载体和插入DNA的 摩尔比调整为1:1，同时增大DNA浓度以便取得良好效果。 (0.05-0.1 gul以上)。 反应温度： 该酶的最适温度为37，由于热稳定性较 差，因此长时间反应时通常需在16下进行。若反应1-2小时 左右的话也可在室温下进行反应。 抑制剂： T4 DNA连接酶要求Mg 2+，因此螯合Mg 2+的EDTA 的存在会阻碍反应。将溶解于含有高浓度EDTA缓冲液中的 DNA准备作为样品使用时，最好先用灭菌蒸馏水或TE缓冲液 进行置换。图例一） 在25，用不同活性单位 （2U、4U、6U）T4 DNA连接酶与 DNA/Hind III 片段作用10分钟后的 结果以及连接产物灭活T4连接酶后再 次使用Hind III酶切结果。泳 道1：DNA/Hind ； 泳道2：DNA/Hind + 2U T4 Ligase； 泳道3：DNA/Hind + 4U T4 Ligase； 泳道4：DNA/Hind + 6U T4 Ligase； 泳道5：DNA/