农作物种子转基因检测技术

赵海艳2015年11月,农作物种子转基因成分检测,一、转基因相关术语二、转基因作物发展现状三、转基因成分检测技术,主要内容,细胞核,细胞,染色体,DNA超螺旋,DNA,基因：本质是一段有表达功能的DNA序列。,一、转基因相关术语,转基因生物（GeneticallyModifiedOrganismsGMO)，就是利用DNA重组技术，将外源目的基因转移到受体生物中去，使之产生定向的、稳定的改变，以满足人类的需要。它克服了天然物种生殖隔离的屏障，可以按照人们的意愿使生物体的遗传性状发生改变，创造出自然界中原来并不存在的新的生物功能和类型。,苹果,香蕉,有苹果色的香蕉,控制苹果颜色的基因,基因工程技术转入香蕉,植物基因工程示意图（农杆菌介导）,花粉管通道法我国科学家独创的方法，将目的基因涂抹在柱头上，或注射进子房内，使外源基因随受精作用进入卵细胞。,基因枪法将基因（外衣）包在“子弹”外，用强大的压力使子弹穿过植物细胞，同时脱下“外衣”,DNA重组过程,基因结构,终止子,基因,表达区域,启动子,启动子：启动子是基因的一个组成部分，控制基因表达（转录）的起始时间和表达的程度。,CaMV35S启动子、FMV35S启动子,终止子(terminatorT)是给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列。在一个操纵元中至少在构基因群最后一个基因的后面有一个终止子。NOS终止子、7S3终止子,内标准基因是指具有植物物种专一性且拷贝数恒定、不显示等位基因变化的保守DNA序列。转基因大豆：lectin（凝集素）基因转基因玉米：invertase（转化酶）基因或zein（玉米醇溶蛋白）基因转基因水稻：sps（蔗糖磷酸合酶）或gos（一个水稻根部表达的基因）基因,BT基因是苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis,Bt)晶体蛋白基因的简称。对鳞翅目鞘翅目昆虫（比如小菜蛾）有很强的杀伤作用。转Bt基因作物，其中以玉米、马铃薯和棉花为主。在我国，转Bt基因的抗虫棉花已得到了商品化生产。,抗除草剂类的基因抗草丁膦、双丙氨酰膦：PPT乙酰转移酶基因（bar）膦丝菌素N-乙酰转移酶基因（PAT）抗草甘膦：cp4-epsps基因草甘膦氧化还原酶基因（Gox）,转化事件指在把外缘DNA导入植物细胞的过程中，特定的外缘DNA与受体DNA在特定染色体、特定位点结合的事件。,1983年第一例转外源基因植物（烟草）获得成功。1987年第一例转基因植物(抗虫西红柿)田间试验在美国进行。1994年美国第一例转基因食品-延熟番茄上市1996年转基因作物种植面积达到170万公顷1998年转基因作物的安全性在世界范围内引起争议2006年全球转基因农作物年种植面积达1亿公顷2009年中国批准了抗虫转基因水稻和转植酸酶玉米2014年全球转基因农作物年种植面积达1.815亿公顷,二、转基因作物发展,美国以7310万公顷的种植面积(占全球的40%)仍然遥遥领先，其主要作物的采用率为90%，其中玉米采用率为93%、大豆94%、棉花96%。而巴西种植面积的同比增长最近5年保持第一。,作物：11类，玉米、大豆、油菜、棉花、甜菜、苜蓿、南瓜、木瓜、甜辣椒、白杨、茄子。其中玉米、大豆和棉花种植面积排在前三位。品种：147个，其中玉米最多，已批准上市的45个。获得批准最多的转化体：抗除草剂大豆事件GTS40-3-2（26个国家欧盟28个成员国的52次批准）抗除草剂玉米事件NK603（25个国家欧盟28个成员国的52次批准）抗虫玉米事件MON810（25个国家欧盟28个成员国的50次批准）抗虫玉米Bt11（24个国家欧盟28个成员国的50次批准）抗虫玉米TC1507（22个国家欧盟28个成员国的47次批准）,转基因作物种类,转基因植物性状分类,抗除草剂的转基因植物（最早进入田间生产，目前栽培面积最大）如孟山都的抗除草剂草甘膦大豆抗虫转基因植物如先正达的Bt176抗虫玉米抗病转基因植物（抗病毒，抗真菌，抗细菌）植物发育调节基因工程（控制果实成熟，雄性不育，改良植物品质）医药领域中的转基因植物（利用植物作为生物反应器，生产药用蛋白、食用疫苗等）抗环境胁迫转基因作物（温度、水分、化学物）,我国转基因作物作物发展,1：已经批准商业化1997年耐储存番茄抗虫棉花1999年改变花色矮牵牛抗病辣椒2006年抗病番木瓜2：发放安全证书2009年抗虫水稻转植酸酶玉米,三、转基因成分检测技术（一）转基因成分检测标准（二）转基因成分检测方法（三）农作物种子PCR检测操作程序,截止到2015年5月，农业系列标准共有171件，涉及转基因成分检测，食用安全性检测，环境安全性检测和安全管理4类。转基因成分检测标准88件，包括通用标准（如抽样，DNA提取）、筛查检测标准，基因特异性检测标准、转化事件特异性检测标准。涉及作物8种。截止到2015年5月，质检总局发布的标准全部是转基因成分检测标准，共计59件，其中植物类47件，涉及作物12种。,（一）转基因PCR检测标准,农业转基因检测标准参数列表（基于PCR技术）,（二）转基因检测方法,蛋白检测法,表型检测法,基因检测法,表型测定是通过检测转基因作物某一特性（性状）的缺失或存在，来判断样品是否为转基因产品。,转基因检测方法-表型检测法,幼苗喷洒试验,逆境发芽试验,利用抗原与抗体的特异性结合的免疫分析法，是检测外源基因表达蛋白最常用的方法，主要分为酶联免疫分析(ELISA)和侧向流动免疫试纸两种。,转基因检测方法-蛋白检测法,农业部1485号公告-14-2010转基因植物及其产品成分检测抗虫转Bt基因棉花外源蛋白表达量检测技术规范,酶联免疫吸附法(ELISA),试纸条法,批样(10吨),送检样品(3kg),检测样品(0.2g),试纸条检测,检测样品,抽样,试纸条检测流程,适合于田间、仓库现场检测,抗虫类：Cry1Ab/Ac、Cry2Ab、Cry1F、Cry3A、Cry3Bb、Cry34Ab1、Vip3A、Cry9C、Cry1C抗除草剂类：CP4EPSPS、PAT/BAR抗生素抗性：NPTII多重试纸条：同时检测多种外源蛋白质,商品化试纸条,优点：快速、简便、准确、不容易污染。缺点：仅适用外源蛋白质；检测靶标种类少；灵敏度有限，非深加工产品；无相应国家标准；应用：现场检测，样品复查、验证。,蛋白免疫检测法优缺点：,以转入的外源基因DNA为靶标，可以为目的基因，也可以为调控元件。,核酸物质（DNA）,Nucleus,转基因检测方法-基因检测法,判断样品中是否含有转基因成分（筛查）,转基因成分检测阶段和要求,判断样品中含有的转基因成分是什么（鉴定）,判断样品中含有的转基因成分是否需要标识（定量）,高覆盖率、简便、快速、经济、样品高通量,准确,精确,转基因检测方法-基因检测法,PCR检测法（普通PCR和实时荧光PCR法）基因芯片检测法环介导等温扩增检测法,转基因检测方法-基因检测法,Mg+,Mg+,Mg+,普通PCR示意图,实时荧光定量PCR是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR所使用的化学物质可分为两种：荧光探针和荧光染料。实时荧光定量PCR不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且比常规PCR相比，它具有特异性更强、自动化程度高、不使用溴化乙锭、不污染环境等特点，目前已得到广泛应用。,实时荧光PCR原理,SYBR荧光染料在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，双链越多，嵌入的SYBR染料越多；而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。用SYBR染料比较方便而且成本低，但在模板浓度较低时，引物二聚体作用影响较大。目前主要采用的还是TaqMan荧光探针。,实时荧光PCR示意图,实时荧光PCR原理,确定检测标准和参数试样制备DNA提取与质量检测PCR体系配置与扩增电泳检测结果分析结果报告,（三）农作物种子PCR检测操作程序,检测参数要有覆盖性（对现有的商业化品系进行系统分析）先筛查后定性。,1、确定检测参数和标准,玉米商业转化体通用元件分析,生物技术通报2013年01期,根据检测的目的，分离足够量的样品进行试验样品的制备。假设送检样品中转基因种子含量为V，应从送验样品中分取适量种子作为试验样品，试验样品数量参照下面公式进行:n=log1-(P/100)/log1-(V/100)n：试验样品种子数量，V：转基因种子含量，P：置信率,2、试样制备,试验样品种子数量,干种子粉碎（细度为0.5mm以下）幼苗液氮研磨直接切种子胚（大粒种子，如玉米）,试样处理,提取方法常规方法（SDS法，CTAB法）：优点DNA提取量大，质量好；缺点：过程繁琐，时间长，工作量大，接触有毒有害试剂。商业提取试剂盒：优点：质量好，快捷；缺点：费用高。快提法（热碱法）：优点：快捷、费用低；缺点：质量不高，保存时间短。适合幼苗、种子胚，用于多样品快速检测。,3、DNA提取与质量检测,1、琼脂糖凝胶电泳2、紫外分光光度计紫外分光光度计测定基因组DNA溶液的OD值（浓度和纯度的测定，OD260/OD280应该在1.8左右，高了表明有RNA污染，低了表明有蛋白质污染）3、提取的DNA应保存在4条件下，避免反复冻融。,质量检测：,玉米种子DNA快速提取过程,设置对照在试样PCR反应的同时，应设置阴性对照、阳性对照和空白对照。用该作物非转基因材料中提取的DNA作为阴性对照；用含有检测对象的转基因作物DNA作为阳性对照（外源基因拷贝数要一样），一般含量为0.1%；用无菌重蒸水作为空白对照。,4、PCR体系配置,反应体系反应体系参照标准要求进行配置，可以根据试验条件的不同做适当调整。试验样品和各种对照的反应体系要一起制备，每个反应至少设两个平行重复。,PCR扩增反应程序参照参照标准要求进行设置。由于试验的条件不同，不同实验室可以根据实际扩增结果对反应程序进行适当调整。反应结束后取出PCR反应管，保存在4条件下，PCR产物应在24小时内进行检测。,扩增程序,实时荧光PCR,5、电泳检测,根据扩增产物片段大小配置适宜浓度的琼脂糖凝胶（一般200bp以下配2%，200bp以上配1.5%。荧光PCR无需电泳。,（1）判定PCR体系工作是否正常内标基因扩增正常：阴性对照、阳性对照和检测样品都应被扩增出，空白对照不能扩增。如未扩增出，未提取到可进行PCR检测的DNA，或DNA提取液中有抑制PCR反应的物质存在，或PCR试剂质量有问题等，应重新提取或者更换试剂。平行试验样品的结果应保持一致。如果一个试验样品的结果为阳性而另一个为阴性时，应重新检测。,6、结果分析,（2）判定外源基因扩增是否正常正常情况：阳性对照得到扩增，阴性和空白对照都未得到扩增，直接记录样品检测结果。,SPS基因内标,CaMV35S启动子,水稻种子样品电泳结果,不正常情况：假阳性:阳性对照得到扩增，阴性和空白也得到扩增，说明系统发生污染.假阴性:阳性对照未得到扩增，说明扩增体系有问题.,假阳性分析：,可能的原因：样品制备过程中来自环境的污染；DNA提取过程中的污染；PCR体系配制过程中的污染（前次PCR产物）。对策：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。,假阴性分析：,可能原因：样品粉碎或混合不够充分；DNA模板质量不好（降解、含有抑制剂）；DNA模板量不够；DNA模板浓度过高。试剂质量不好（引物和酶）,对策：重新粉碎样品；进行充分纯化，去除抑制剂（盐、糖、酚等）；稀释DNA模板量过高换引物和酶等试剂,阈值设定实时荧光PCR反应结束后，设置荧光信号阈值，阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。,荧光PCR结果分析,CT值,质量控制空白对照：内源基因检测Ct值40，外源基因检测Ct值40；阴性对照：内源基因检测Ct值34，外源基因检测Ct值40；阳性对照：内源基因检测Ct值34，外源基因检测Ct值36；上述指标有一项不符合者，说明PCR反应体系不正常，应重新进行实时PCR扩增。,荧光PCR结果分析,检测样品内源基因检测Ct值24，外源基因检测Ct值40，则可判定该样品不含外源基因。检测样品